SPR光譜信號(hào)的無(wú)基線質(zhì)心法*

王曉萍，董聯(lián)紅，詹舒越

(浙江大學(xué)光電系現(xiàn)代光學(xué)儀器國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州310027)

表面等離子體共振(Surface Plasmon Resonance，SPR)檢測(cè)技術(shù)以其靈敏度高、所需試樣少、樣品無(wú)需標(biāo)記、響應(yīng)速度快、可實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)監(jiān)控等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于生物、食品、醫(yī)療、環(huán)境等領(lǐng)域［1－6］。從 BiacoreTM(Uppsala Sweden)公司發(fā)布商業(yè)SPR儀器以來(lái)，SPR傳感器與檢測(cè)儀器得到飛速發(fā)展。目前，SPR傳感器和檢測(cè)儀器的主要發(fā)展方向是高靈敏、高分辨率、高通量、多通道及小型化［7－10］。對(duì)于最常見(jiàn)的角度調(diào)制型SPR傳感器和檢測(cè)儀器，其SPR共振角的確定方法對(duì)提高儀器信噪比和分辨率等指標(biāo)具有重要作用，因此研究快速有效的SPR共振角計(jì)算方法具有重要意義。

常用的SPR共振角計(jì)算方法有質(zhì)心法、多項(xiàng)式擬合法、特定反射率法、一階導(dǎo)數(shù)過(guò)零點(diǎn)法［11－12］等。其中，質(zhì)心法由于運(yùn)算簡(jiǎn)單、所需時(shí)間少，而得到廣泛應(yīng)用。目前對(duì)于質(zhì)心法的研究主要集中于如何進(jìn)一步抑制噪聲、提高分辨率。Nenninger等［13］提出的固定寬度動(dòng)態(tài)基線質(zhì)心法，Thirstrup等［14］提出的基于面積的動(dòng)態(tài)基線質(zhì)心法，以及酈雅平等［15］提出的基于幅值的動(dòng)態(tài)基線質(zhì)心法，均能有效抑制光源光強(qiáng)波動(dòng)引起的SPR共振角波動(dòng);Johansen等［16］提出的加權(quán)質(zhì)心算法，可以提高分辨率。

本文提出了一種無(wú)基線質(zhì)心法，該方法具有運(yùn)算速度快、受光源波動(dòng)影響小、信噪比高、分辨率高等特點(diǎn)。對(duì)具有明顯光源光強(qiáng)波動(dòng)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和寬折射率范圍樣品的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，分別采用固定基線質(zhì)心法、基于幅值的動(dòng)態(tài)基線質(zhì)心法以及本文提出的無(wú)基線質(zhì)心法進(jìn)行分析研究，結(jié)果表明無(wú)基線質(zhì)心法運(yùn)算簡(jiǎn)單、不受光源波動(dòng)影響，且具有較高的信噪比和分辨率。

1 算法描述

SPR共振角通常用SPR反射光譜共振點(diǎn)對(duì)應(yīng)的像素位置(共振像素)表示。質(zhì)心法首先要選定一條基線，然后按式(1)可求得該基線和SPR光譜曲線所構(gòu)圖形的質(zhì)心，并將質(zhì)心對(duì)應(yīng)的像素值作為共振像素。

式中i是像素值，i1和i2分別為基線與SPR光譜相交的第一像素點(diǎn)(起始像素)和第二像素點(diǎn)(終止像素)，Ri為像素i對(duì)應(yīng)的光譜值。

1．1 固定基線質(zhì)心法

固定基線質(zhì)心法的基線一般取SPR曲線約2/3深度的位置，其參數(shù)為基線的高度，如圖1所示，通常根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來(lái)確定。該方法簡(jiǎn)單，但光源波動(dòng)引起的SPR光譜曲線的整體偏移會(huì)影響共振像素。如圖2所示，假設(shè)SPR光譜1受光源波動(dòng)影響，正向移動(dòng)數(shù)值0．2到SPR光譜2位置，由于被測(cè)介質(zhì)折射率沒(méi)變，所以SPR光譜的形狀不變。若采用固定基線1分別計(jì)算光譜1和光譜2的共振像素，由于兩光譜與基線1所構(gòu)圖形的面積不同，得到的質(zhì)心位置也不同，所以共振像素位置不同。由此可見(jiàn)，固定基線法易受光源波動(dòng)的影響。

圖1 固定基線質(zhì)心法與無(wú)基線質(zhì)心法示意圖

圖2 光源光強(qiáng)波動(dòng)對(duì)固定基線、動(dòng)態(tài)基線、無(wú)基線質(zhì)心法的影響效果

1．2 動(dòng)態(tài)基線質(zhì)心法

動(dòng)態(tài)基線質(zhì)心法的基線隨著SPR光譜的變化而變化，如圖2所示。當(dāng)光譜1因光強(qiáng)波動(dòng)偏移到光譜2位置時(shí)，基線也動(dòng)態(tài)變化到基線2位置。分別計(jì)算基線2與光譜2所構(gòu)圖形以及基線1與光譜1所構(gòu)圖形的質(zhì)心，由于兩圖形面積基本相等，質(zhì)心位置也基本相同，所以共振像素位置基本不變。由此可見(jiàn)，動(dòng)態(tài)基線質(zhì)心法對(duì)光源波動(dòng)不敏感，但其計(jì)算過(guò)程比固定基線法稍為復(fù)雜。對(duì)于引言中介紹的三種動(dòng)態(tài)基線質(zhì)心法，基于幅值的動(dòng)態(tài)基線法相比其它兩種動(dòng)態(tài)基線法，不僅受光源波動(dòng)影響小，而且更加簡(jiǎn)單快速。所以本文采用基于幅值的動(dòng)態(tài)基線法作為對(duì)比算法，該方法依據(jù)基線位于SPR曲線約2/3高度的原則，根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)確定其算法參數(shù)—幅值比［15］。

1．3 無(wú)基線質(zhì)心法

本文提出的無(wú)基線質(zhì)心法，是通過(guò)計(jì)算如圖1所示陰影部分的質(zhì)心，來(lái)確定共振像素，其參數(shù)為起始像素和終止像素。根據(jù)這兩個(gè)參數(shù)確定的左右邊界與SPR光譜及像素坐標(biāo)軸構(gòu)成的圖形，再利用式(2)［17］計(jì)算得到其質(zhì)心和像素。

起始像素和終止像素根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)確定，對(duì)于窄折射率范圍樣品實(shí)驗(yàn)，起始像素和終止像素對(duì)應(yīng)的反射率要求在SPR曲線約2/3的高度位置;而對(duì)于寬折射率范圍樣品實(shí)驗(yàn)，由于共振像素變化范圍較大，為準(zhǔn)確獲得寬折射率范圍樣品的SPR光譜共振像素，所選像素范圍也應(yīng)變寬。

討論光源波動(dòng)對(duì)該算法的影響，如圖2所示，當(dāng)光譜1變到光譜2時(shí)，左右垂直邊界線與光譜2及像素坐標(biāo)軸構(gòu)成的圖像只是在光譜1對(duì)應(yīng)圖形基礎(chǔ)上增加一個(gè)矩形。當(dāng)光源波動(dòng)引起SPR光譜偏移時(shí)，矩形的寬度沒(méi)有改變，兩個(gè)矩形的質(zhì)心對(duì)應(yīng)的像素保持不變，整體共振像素位置基本不受影響。因此，該算法計(jì)算共振像素不受光源波動(dòng)影響，可有效抑制噪聲。

2 實(shí)驗(yàn)研究

2．1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)材料包括SpreetaTM傳感器(128像素線陣CCD，Texas Instruments Inc．，USA)、HPLC 進(jìn)樣閥(C4 －1004 －．5，Valco Instruments Inc．，Switzerland)、HPLC 泵(UC－3281，北京優(yōu)聯(lián)光電科技公司)、工業(yè)注射泵(MSP1－C1，中國(guó)保定蘭格公司)、十通選擇閥(EMHMA-CE，Valco Instruments Inc．，Switzerland)和阿貝折射率儀(上海申光儀器公司)，樣品為中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)的氯化鈉(NaCl，分析純)和蔗糖(C12O22H11，分析純)。

2．2 實(shí)驗(yàn)方法

雙重蒸餾水作為溶劑配制NaCl標(biāo)準(zhǔn)溶液:濃度分別為 0．1 mg/mL、0．2 mg/mL、0．3 mg/mL、0．4 mg/mL、0．5 mg/mL、1 mg/mL;蔗糖標(biāo)準(zhǔn)溶液:濃度分別為 0．1%、0．2%、0．4%、0．6%、0．8%、1%、2%、4%、6%、8%、10%。同時(shí)雙重蒸餾水也作為緩沖液。

由HPLC進(jìn)樣閥和HPLC泵構(gòu)成NaCl溶液實(shí)驗(yàn)的SPR進(jìn)樣系統(tǒng)，由十通選擇閥和工業(yè)注射泵構(gòu)成蔗糖溶液實(shí)驗(yàn)的SPR進(jìn)樣系統(tǒng)，SpreetaTMSPR傳感器輸出的SPR光譜數(shù)據(jù)，由計(jì)算機(jī)采集處理。實(shí)驗(yàn)時(shí)，NaCl標(biāo)準(zhǔn)溶液和蔗糖標(biāo)準(zhǔn)溶液從低濃度到高濃度分別檢測(cè)了4次和3次。

3 結(jié)果與分析

3．1 運(yùn)算速度

對(duì)NaCl標(biāo)準(zhǔn)溶液的23 429組光譜數(shù)據(jù)，分別采用固定基線質(zhì)心法、動(dòng)態(tài)基線質(zhì)心法和無(wú)基線質(zhì)心法計(jì)算SPR共振像素，它們的平均運(yùn)算時(shí)間分別為0．81 s和 0．83 s 和 0．70 s。對(duì)蔗糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的108 259組光譜數(shù)據(jù)，也采用三種質(zhì)心法計(jì)算，所需的平均運(yùn)算時(shí)間分別為 3．50 s、3．55 s 和 3．20 s。結(jié)果表明，無(wú)基線質(zhì)心法具有最快的運(yùn)算速度。

3．2 NaCl溶液實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

在低濃度NaCl溶液檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，光源噪聲表現(xiàn)明顯。用三種質(zhì)心法處理光譜數(shù)據(jù)時(shí)，也結(jié)合運(yùn)用平方加權(quán)算法以減小結(jié)果的線性偏差［16］。根據(jù)三種質(zhì)心法最佳參數(shù)的確定原則，得到固定基線質(zhì)心法的基線值是0．85，幅值動(dòng)態(tài)基線法基線高度比是0．35，無(wú)基線質(zhì)心法的像素范圍是65到97，運(yùn)用三種質(zhì)心法計(jì)算獲得的SPR傳感監(jiān)控圖(共振像素隨時(shí)間的變化)如圖3(a)～圖3(c)。從圖可見(jiàn)，固定基線法受光源波動(dòng)等因素影響明顯，另兩種質(zhì)心法受光源波動(dòng)影響明顯較小。

進(jìn)一步分析它們的信噪比(SNR)，以每個(gè)濃度對(duì)應(yīng)的四個(gè)檢測(cè)峰的平均值作為信號(hào)，峰值之前蒸餾水緩沖液信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差平均值作為噪聲，三種算法的信噪比－樣品濃度的線性擬合曲線如圖3(d)所示。由圖可見(jiàn)，無(wú)基線質(zhì)心法具有較高的信噪比。

圖3 NaCl溶液實(shí)驗(yàn)SPR監(jiān)控圖及分析結(jié)果

3．3 蔗糖溶液實(shí)驗(yàn)結(jié)果和性能指標(biāo)

同樣根據(jù)三種質(zhì)心法最佳參數(shù)的確定原則，得到固定基線質(zhì)心法的基線值是0．63，幅值動(dòng)態(tài)基線法的基線高度比是0．33;由于蔗糖溶液濃度范圍寬，使得SPR共振像素變化范圍較大，因此無(wú)基線質(zhì)心法的像素范圍確定為27到112。

與NaCl實(shí)驗(yàn)分析方法相似，首先運(yùn)用三種質(zhì)心法計(jì)算獲得SPR傳感監(jiān)控圖如圖4(a)～圖4(c)，再根據(jù)監(jiān)控圖可得到三種方法信噪比的二階多項(xiàng)式擬合曲線，如圖4(d)所示。由圖可見(jiàn)，無(wú)基線質(zhì)心法具有較高的信噪比。

運(yùn)用阿貝折射率儀分別測(cè)量濃度為0%、1%、2%、4%、6%、8%和10%的蔗糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，得到它們的折射率為 1．332 0、1．333 5、1．335 0、1．337 9、1．340 6、1．343 4 和1．346 4。對(duì)這些數(shù)據(jù)進(jìn)行線性擬合可得到濃度與折射率的校準(zhǔn)方程RI=1．332 08+0.142 75×C，據(jù)此方程可計(jì)算出濃度為0．1%、0．2%、0．4%、0．6%和0．8%的蔗糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的折射率分別為1．332 2、1．332 4、1．332 7、1．332 9 和1．333 2。

圖4 蔗糖溶液實(shí)驗(yàn)SPR監(jiān)控圖及分析結(jié)果

根據(jù)各濃度蔗糖溶液的共振像素(P)和各濃度蔗糖溶液對(duì)應(yīng)的折射率(R)，運(yùn)用二階多項(xiàng)式擬合得到共振像素—折射率校準(zhǔn)(P－R)曲線如圖5所示。實(shí)際樣品測(cè)量時(shí)，根據(jù)SPR檢測(cè)到的共振像素以及該P(yáng)－R校準(zhǔn)曲線，可以得到樣品的折射率。

圖5 三種算法對(duì)應(yīng)的共振像素－折射率校準(zhǔn)曲線

根據(jù)靈敏度(SRI)的定義dP/dR，以及P－R的二次校準(zhǔn)方程(曲線)，靈敏度是一個(gè)與R有關(guān)的變量。在選取R=1．3320時(shí)，三種質(zhì)心法的靈敏度分別為2 530．906，2 535．495 和1 577．654 Pixel/RIU。

折射率分辨率(σRI)的定義為，其中為噪聲水平。以監(jiān)控圖峰值之前緩沖液信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的平均值作為噪聲，三種質(zhì)心法的噪聲分別為0．001 072，0．000 887 和 0．000 484，結(jié)合上面得到的靈敏度SRI，可以得到三種質(zhì)心法的分辨率分別為4．24，3．50，3．07×10－7RIU。結(jié)果表明無(wú)基線質(zhì)心法的分辨率最高。

從蔗糖溶液實(shí)驗(yàn)可知，無(wú)基線質(zhì)心法的靈敏度比其它兩種方法小，信號(hào)響應(yīng)值略低，但噪聲抑制程度比其它兩種方法大，所以信噪比和分辨率比其它兩種方法略高一些。可見(jiàn)該算法在選取合理參數(shù)條件下，能有效抑制噪聲水平，在提高運(yùn)算速度的同時(shí)，信噪比和分辨率略優(yōu)于其它兩種方法，在窄折射率范圍和寬折射率范圍的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中均可使用。

4 結(jié)論

提出并研究了一種SPR共振角的快速計(jì)算方法。對(duì)多種質(zhì)量濃度的氯化鈉和蔗糖溶液的SPR光譜數(shù)據(jù)，分別運(yùn)用固定基線質(zhì)心法、基于幅值的動(dòng)態(tài)基線質(zhì)心法和無(wú)基線質(zhì)心法計(jì)算共振像素，得到三種方法的SPR監(jiān)控曲線。分析結(jié)果表明，無(wú)基線質(zhì)心法不僅對(duì)光源波動(dòng)不敏感，而且在運(yùn)算速度、信噪比、分辨率等方面都具有一定優(yōu)勢(shì)。在自行開(kāi)發(fā)的SPR檢測(cè)系統(tǒng)中加以應(yīng)用，體現(xiàn)出該方法對(duì)提高SPR檢測(cè)系統(tǒng)的性能指標(biāo)具有重要作用。后續(xù)將在自行研制的多通道SPR傳感器中，運(yùn)用該方法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，進(jìn)一步明確方法參數(shù)的確定原則。

［1］ Shankaran D R，Gobi K V，Miura N．Recent Advancements in Surface Plasmon Resonance Immunosensors for Detection of Small Molecules of Biomedical，F(xiàn)ood and Environmental Interest［J］．Sensors and Actuators B:Chemical，2007，121(1):158－177．

［2］ 劉國(guó)華，張維，常露，等．SPR生物傳感系統(tǒng)及其對(duì)DNA的檢測(cè)分析［J］．傳感技術(shù)學(xué)報(bào)，2006，18(4):700－704．

［3］ 鄭榮升，魯擁華，林開(kāi)群，等．表面等離子體共振傳感器研究的新進(jìn)展［J］．量子電子學(xué)報(bào)，2008，25(6):657－664．

［4］ 崔大付，張璐璐，王于杰，等．表面等離子諧振(SPR)生化分析儀的研制與發(fā)展［J］．現(xiàn)代科學(xué)儀器，2007，(2):3－7．

［5］ 陳悅，崔大付，蔡浩原，等．小型SPR生物傳感器的研制［J］．傳感器與微系統(tǒng)，2006，25(12):79－81．

［6］ 謝永紅，王耀玲，程小麗，等．SPR生物傳感器在急性白血病髓系抗原CD33檢測(cè)中的應(yīng)用［J］．傳感技術(shù)學(xué)報(bào)，2011，24(1):1－4．

［7］ Chinowsky T M，Grow M S，Johnston K S，et al．Compact，High Performance Surface Plasmon Resonance Imaging System［J］．Biosensors and Bioelectronics，2007，22(9－10):2208－2215．

［8］ Vanwiggeren G D，Bynum M A，Ertel J P，et al．A Novel Optical Method Providing for High-Sensitivity and High-Throughput Biomolecular Interaction Analysis［J］．Sensors and Actuators B:Chemical，2007，127(2):341－349．

［9］ 張維，徐寧，謝海燕，等．基于二元光學(xué)的多通道SPR傳感芯片及其系統(tǒng)設(shè)計(jì)［J］．傳感技術(shù)學(xué)報(bào)，2009(8):1099－1104．

［10］ Chinowsky T M，Soelberg S D，Baker P，et al．Portable 24-Analyte Surface Plasmon Resonance Instruments for Rapid，Versatile Biodetection［J］．Biosensors and Bioelectronics，2007，22(9 －10):2268－2275．

［11］ Chinowsky T M，Jung L S，Yee S S．Optimal Linear Data Analysis for Surface Plasmon Resonance Biosensors［J］．Sensors and Actuators B:Chemical，1999，54(1－2):89－97．

［12］ Owega S，Poitras D．Local Similarity Matching Algorithm for Determining SPR Angle in Surface Plasmon Resonance Sensors［J］．Sensors and Actuators B:Chemical，2007，123(1):35－41．

［13］ Nenninger G G，Piliarik M，Homola J．Data Analysis for Optical Sensors Based on Spectroscopy of Surface Plasmons［J］．Measurement Science and Technology，2002，13:2038－2046．

［14］ Thirstrup C，Zong W．Data Analysis for Surface Plasmon Resonance Sensors Using Dynamic Baseline Algorithm［J］．Sensors and Actuators B:Chemical，2005，106(2):796－802．

［15］酈雅平，王曉萍，趙光燦，等．SPR光譜信號(hào)的一階矩?cái)?shù)據(jù)分析方法［J］．浙江大學(xué)學(xué)報(bào):工學(xué)版，2010，44(12):2269－2273．

［16］ Johansen K，St Lberg R，Lundstr M I，et al．Surface Plasmon Resonance:Instrumental Resolution Using Photo Diode Arrays［J］．Measurement Science and Technology，2000，11:1630－1638．

［17］郝鵬，吳一輝．基于噪聲分析的波長(zhǎng)表面等離子體共振分析儀的數(shù)據(jù)處理［J］．光學(xué)精密工程，2009，17(9):2159－2164．