喉癌組織的蛋白質組學比較研究

[摘要] 目的 通過對人類的喉癌組表達差異中的高、低分化癌組之間的相互差異性的研究，運用網上數據庫對不同蛋白點的肽指紋圖進行分析和鑒定。 方法 選取本院耳鼻喉科2011年1~5月喉癌患者的病理臨床資料進行回顧性分析與研究。 結果 隨機將新鮮喉癌標本分為高分化癌組和低分化癌組，并提取兩組的組織總蛋白進行雙向凝膠電泳分析，將分析結果與正常黏膜組織對照，將得到的高分化與低分化癌組織之間的表達式進行比較分析。 結論 高分化癌組織與低分化癌組織的表達顯示，喉癌細胞的分化程度與蛋白質組學的關系極為密切。

[關鍵詞] 喉癌；蛋白質組學；雙向凝膠電泳

[中圖分類號] R739.65 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2012）06-0031-03

Comparative proteomic analysis of differentiation cancer of larynx

LV Jingyao LI Zhihai CAI Zhiyi

Department of Otolaryngology， Taizhou Hospital in Zhejiang Province， Taizhou 318000， China

[Abstract] Objective To study on differences of human laryngeal carcinoma group expression in high， low cancer group， using online databases of different protein spots of the peptide fingerprint analysis and identification. Methods Analysis and study on ENT pathology retrospectively clinical data from 2011 January to 2011 May in our hospital. Results The fresh specimens of laryngeal carcinoma classified as well-differentiated cancer group and the low differentiation cancer group. The extraction of two groups of tissue protein， for two-dimensional gel electrophoresis， compared to the normal mucosa tissue. Conclusion High differentiation carcinoma and poorly differentiated cancer tissues expression shows， laryngeal cancer cell differentiation and proteomics have very close relationship.

[Key words] Laryngeal cancer; Proteomics; Two-dimensional gel electrophoresis

目前喉癌的發病率約占全身惡性腫瘤的5％，是頭頸部腫瘤中較為常見的惡性腫瘤，喉癌的總體生存率低，就算積極投入治療，現階段的醫療水平對其生存率并無明顯改善。近年來，隨著經濟的發展，人類的生存環境日趨惡化，喉癌的發病率也呈現逐年遞增的趨勢。蛋白質組學是從整體上研究其在不同時間和空間中所發揮的功能及蛋白質間的相互作用的一門新興的學科，其特征就是建立雙向電泳差異圖譜，采用透視全體基因在特定細胞或組織的動態表達的分析方法，從而達到解釋蛋白質功能與細胞生命活動的規律[1-3]。另外，還有部分的實驗室將研究的結果建立了數據庫，以利于蛋白質組學技術在腫瘤研究的中臨床應用。本文選取本院耳鼻喉科2011年1~5月喉癌患者的病理臨床資料6例進行回顧性分析與研究，通過運用網上數據庫對人類的喉癌組織表達差異中的高、低分化癌組之間的相互差異性的研究，從而達到對不同蛋白點的肽指紋圖的分析和鑒定，并總結分析，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取本院耳鼻喉科2011年1~5月喉癌患者的臨床資料6例進行回顧性分析與研究。6例喉癌患者中，男4例，女2例，年齡30～60歲，病理結果顯示其病理組織來源于鱗狀上皮組織，其中高分化鱗癌2例，低分化鱗癌4例。６例患者均作為蛋白質組研究的組織標本，同時選取對側未被腫瘤侵犯的正常喉室或室帶黏膜作為對照組的正常黏膜，6例配對的癌旁正常喉黏膜組織均距離腫塊邊緣達5 cm以上。

1.2 研究方法

1.2.1實驗的試劑與儀器的備用 組織物備用：將所有選取的喉癌組織及正常黏膜均用冰鹽水清洗干凈，濾紙吸去多余的液體1 min后將其置于-70℃冰箱保存備用，此項過程的處理需于組織離體后30 min內完成。

試劑備用：選用超純尿素（urea）、甘氨酸（glycine）、硫脲（sulfocarbamide）、四甲基乙二胺（TEMED）、十二烷基磺酸鈉（SDS）和低分子量蛋白標記Tris堿、pH 3～10固相化線性17 cm干膠條(IPG strip)購自Bio-Rid公司。CHAPS（兩性離子去垢劑）、二硫蘇糖醇（DTT）、10固相化線性13 cm干膠條及考馬斯亮藍R-250，以上均購自上海生工公司。

儀器備用：選用低溫高速離心機（Beckman公司）、Imagescanner掃描儀（Amersham Pharmacia公司）、真空冷凍干燥儀（Savant speed VacUVS400）、Ettan DALT垂直電泳槽（Amersham Pharmacia公司）、Voyager-DE STR 4307 MALDI-TOF-MS質譜儀（Applied Biosystem公司）和IPGphor等電聚焦儀（Amersham Pharmacia公司）等。

1.2.2 具體操作方法 雙向電泳樣品的制備：從喉癌黏膜組織中提取蛋白質80 mg作為樣品，加入組織裂解液，其中尿素7 mol/L，DTT 65 mol/L、硫脲2 mol/L、Tis 50 mmol/L、充入4％CHAPS、1 mmol/L PMSF混合，放置于4℃下20 min，然后加入DNA酶0.1 g/L，置于冰浴上再給予勻漿器以手工勻漿5 min后，吸取其上清液，所得就是組織的總蛋白質，再輔予RNA酶0.025 g/L，取其上清組織進行分裝，貯存于-70℃冰箱備用。

BCA法測提取液中的蛋白質濃度：選取BCA蛋白定量試劑盒（按50體積Solution A加以體積Solution B（50∶1）的完全溶解蛋白標準品，再配置適量的BCA工作液，使其最終達到濃度0.5 mg/mL，然后充分混勻蛋白質樣品，置于室溫24 h內穩定及其標準品均用PBS稀釋的BCA工作液中，然后適當增加體積樣品于標準品稀釋液中，再將稀釋后的標準品加入標準品稀釋液的將所有標準品中，具體均于各孔中加入LBCA作為工作液，放置30～60 min冷卻后達到室溫的程度時，再采用酶標儀測進行測定波長的吸光度，予以標準曲線進行計算，其所得出的結果就是樣品中的蛋白濃度。

將以上的分析與喉高分化鱗癌和低分化鱗癌相結合，與癌旁正常黏膜組織進行了2-DE比較，并將三組中斑點位置清晰的圖像分別進行合成和分析。

2 結果

2.1 雙向凝膠電泳結果

如圖A所示，圖像顯示出現低分化癌組中有7個特異表達或表達上調超過3倍的蛋白點，其高、低分化喉癌組織和癌旁正常黏膜組織的大部分蛋白斑點分子量均位于20.1~116 kD及pI 4~8的區域。在高分化癌組中有6個特異表達或表達上調超過3倍的蛋白點出現，位于30～80 kD及pI 4.5～7.5區域中的蛋白質斑點分布非常密集，呈現3塊合成膠的表現。將兩組進行兩兩比較之后，發現高分化癌組與正常組的平均匹配率為70．1％，蛋白斑點數約為600～950之間，蛋白質斑點清晰可辨。

如圖B所示，運用PD-quest7．0軟件分析3組凝膠圖。①喉組織的高低分化兩組的pH極酸和極堿性蛋白質的含量均較少，有兩個蛋白點的位置基本相同；高、低分化癌組中均有特異表達；低分化癌組與正常組的平均匹配率為71.9％。②正常組平均檢測的蛋白點為（606±65），在高分化癌組中有4個特異表達或表達上調的蛋白點。

將喉癌高低分化組織中共同的特異性標志物與癌旁正常黏膜組織相比：高低分化癌組中均有5個特異表達或表達上調的蛋白點，結合肉眼觀察得出；低分化癌組平均檢測的蛋白點為（832±49）個，高分化癌組的平均檢測蛋白點（846±57）個。

2.2 蛋白質點的鑒定結果

在相同的實驗條件和參數的情況下，從差異蛋白質斑點中分辨最清楚的蛋白點上選取一對組織中表達相差3倍以上的點，然后在喉癌及正常黏膜組織凝膠圖像中進行標記，重復三次操作，以酶自降解峰進行校正，然后對5對組織中具有相同變化的蛋白點處進行切取并進行MALDI-TOF-MS分析，結果視為差異蛋白質點。最后將所獲得的肽質量指紋圖以空白膠作陰性對照，軟件識別其有效肽片段峰后查詢數據庫，獲得了肽質量指紋圖。差異表達蛋白質的生物學功能初步分析獲得蛋白質分子量及等電點，與網上的雙向凝膠電泳數據庫對比分析發現，組中與數據庫中基因存在相似的位點。見表1。

3 討論

隨著科學的高速發展，人類的基因組全序列測定理論和技術也得到了長足的發展和完善，近年來，后基因組時代的功能基因組學發展迅速，能從組織或細胞蛋白質的整體和動態水平的全新角度來研究疾病的發病機制[3]。而作為功能基因組學重要內容之一的蛋白質組學（proteomics）[4]也被廣泛應用于人類疾病的發病機制、治療和藥物篩選的研究之中，并取得了可喜的成果。而蛋白質組學研究的迅速發展，源于雙向凝膠電泳技術[5]的創立和有效運用，其對組織成分的復雜性及人體的個體差異的獨特分析作用，已被作為當前分離組織細胞蛋白質組的核心技術來運用，在細胞系的研究發展史上起到關鍵性作用[6]。

本實驗對組織標本的選取及對樣量進行了多次的摸排的研究，使其重復性大大增加。在樣品制備和雙向膠的制備以及考染過程等盡量保持統一性，最終獲得了高分化、低分化喉癌組織及癌旁正常黏膜組織等三種組織中固相pH梯度2-DE圖譜，而且圖像清晰、分辨率高和具有極高的重復性，可反復試驗。

樣本的收集和處理實驗過程中由于蛋白質的樣品會被特異組織蛋白質污染，要想獲得圖像清晰、分辨率高和重復性好的2-DE圖譜則需要做好樣本的收集和處理，以避免受到污染而影響實驗結果[7]。需要特別注意的是新鮮組織樣本取得之后，一定要用濾紙吸干樣本上表面所黏附的水分，在樣本清洗濾干后，應立即去除其他組織，并用生理鹽水徹底洗去表面的血液及黏液，以免發生組織蛋白降解和結構破壞的現象。

樣品的制備中減少分離步驟因為鹽的濃度過高會降低等電聚焦的電壓，其蛋白質樣品的制備是2-DE中最為關鍵的一步，甚至會損壞IPG膠條破壞蛋白質與其他生物大分子的相互作用；而降解酶的活性會造成2-DE獲取的直接失敗，所以為了避免蛋白質在抽提過程中被丟失和破壞，處理這一步的結果好壞會直接影響到2-DE圖譜的顯示。提取樣品蛋白質過程中使其處于完全變性狀態，應盡可能提高樣品的溶解度，必須考慮除去影響蛋白質可溶性和2-DE重復性的物質，樣品制備的失敗很難通過后續工作的完善或改進獲得補償。所以，抽提最大量的總蛋白，常常會釋放出各種蛋白酶和蛋白質修飾的酶類，比如核酸、脂、多糖等大分子以及鹽類小分子，以及加蛋白酶抑制劑等，會明顯減少蛋白質的損失。所以，實驗應盡量在低溫下進行，以避免大分子的存在阻塞凝膠孔徑，以達到減少對蛋白質的人為修飾的目的。

在樣品數量增加的時候，除了會引發雙向電泳圖譜的畸變外，影響2-DE的結果。蛋白質具有凝集和沉淀的特點，而這些特點則會造成豐度較高的點，特別是在第一向電泳的時候會更加明顯。如果再加大以上樣品量時能夠增加凝膠上點的數目，以至進行第二向的電泳時，當樣品量過大時則會出現豐度高的蛋白質點掩蓋豐度低的蛋白質點的現象，最后從而產生2-DE圖譜上水平和垂直的條紋。

在上樣量為1 mg總蛋白時，會導致2-DE圖譜上的分辨率下降，只有這樣才會在第一向電泳完畢后才能夠獲得清晰、分辨率高和重復性好的2-DE圖譜。另外，需在IPG膠條在第二向電泳平衡兩次后，測定樣品蛋白質的濃度。

每次15 min的雙向凝膠間的界面精密接觸時，其水的純度對染色結果會造成明顯的影響，表現為在第一次平衡時會出現減少電內滲的現象，不能單純縮短平衡的時間，否則會出現接觸不好或兩者之間有氣泡的出現，所以遇到這個問題時，需使用去離子水（電導<2 s）的方法進行解決，以利于蛋白從第一向到第二向的轉移，從而影響到一部分蛋白從IPG膠條轉移到SDS膠的效率，最后達到在轉移時分子行擴散的目的。加入碘乙酰胺在第二次平衡的步驟中，需保證所有的染色器皿絕對干凈，其染色過程中也需避免直接用手接觸凝膠。解決這個問題需備用一次性手套或無粉乳膠手套；另外，所有的化學試劑一定要分析純（AR），并且盡量使用進口的試劑，以除掉多余的DTT（考染過程中，DTT會導致點拖尾），以便更好地在實驗中確保2-DE圖譜的質量。

比較腫瘤組織與正常組織中的蛋白質在表達數量的差異時，對喉癌和喉正常組織進行了三次重復性2-DE實驗。實驗結果發現，尋找與癌變機制相關蛋白的關鍵就是尋找與癌變相關的特異蛋白質和獲得分辨率較高的組織參考圖譜，而發現腫瘤分子標記的有效途徑就是重復蛋白斑點數目的匹配率需在85％以上。

以癌旁正常的黏膜組織作為對照物，因為高分化與低分化喉癌的圖譜之間存在較好的可比性。在2-DE實施分離和可視化的蛋白質數量多少能局部反映組織蛋臼質組的改變，代表了喉癌與正常組織的差異性。本研究運用了目前蛋白質組學研究中所使用的進行蛋白質分離純化技術中最為常用的一種技術——2-DE技術，充分運用其作用機制，通過調節固相的pH梯度干膠條的等電點區間或應用大面積SDS-PAGE膠，能同時分離展示細胞或組織中成百上千的蛋白質，從而最終達到進一步提高差異蛋白質點的分析和鑒定目的，并能通過一向等電聚焦使不同的蛋白質按等電點聚集的特性，最后使更多的蛋白質得到較為清晰和高分辨率的展現，局部地反映部分組織蛋白質組的改變。

4 結論

本研究在喉癌組織和正常喉黏膜組織的蛋白質表達圖譜的獲得中發現，經質譜分析及生物信息學技術能初步鑒定喉癌組織的部分差異蛋白質，并能通過凝膠圖像的分析找到喉癌組織和正常喉黏膜組織之間的差異蛋白，而其中有部分蛋白可能與喉癌發生發展具密切相關關系[7]。而這些差異蛋白能否作為喉癌診斷的標記物和治療靶標，建立喉癌蛋白質組數據庫，尚需進一步研究。本研究為整體上認識喉癌以及探索喉癌早期診斷和早期治療的研究提供一定的理論依據。

[參考文獻]

[1] 葛俊恒，趙瑞利，胡俊蘭． 晚期喉癌的綜合治療分析[J]. 中華耳鼻咽喉科雜志，2004，39（1）：20-23．

[2] 肖雪媛，趙小冬，劉劍凱，等. 利用蛋白質組學方法篩選及確定喉癌診斷的標志分子[J]. 中國科學：C輯，2004，34（1）：49-53．

[3] 張茹，肖健云，趙索萍． 喉癌及喉正常黏膜組織蛋白質組差異表達的初步研究[J]． 中國耳鼻咽喉顱底外科雜志，2004，10（3）：136-139．

[4] 詹顯全，陳主初，關勇軍，等． 雙向凝膠電泳一飛行時間質譜法分析人肺鱗癌細胞蛋白質組成分[J]. 癌癥，2001，2（18）：575-582.

[5] 熊興東，許麗艷，沈忠英，等. 雙向凝膠電泳圖像分析方法的建立[J]. 癌變·畸變·突變，2002，14（3）：139-143.

[6] 賈宇峰，林秋霞，郭堯君，等． 蛋白質雙向電泳圖像分析[J]． 生物化學與生物物理進展，2001，28（2）：247-250．

[7] 陳平，謝錦云，粱宋平． 雙向凝膠電泳銀染蛋白質點的肽質譜指紋圖分析[J]． 生物化學與生物物理學報，2000，32（4）：387-391．

（收稿日期：2011-11-10）