人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與髓核細(xì)胞共培養(yǎng)后的類髓核分化效應(yīng)及其對(duì)髓核細(xì)胞表型的調(diào)節(jié)作用

[摘要] 目的 探討人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分別與正常及退變髓核細(xì)胞共培養(yǎng)后的類髓核分化效應(yīng)及其對(duì)髓核細(xì)胞表型的調(diào)節(jié)作用并進(jìn)行比較。 方法 取來源于腰椎退變患者以及脊柱側(cè)彎患者的間盤組織，通過改良Pfirrmann法對(duì)其退變程度進(jìn)行分級(jí)，進(jìn)行髓核細(xì)胞（NPCs）的分離培養(yǎng)及鑒定，通過術(shù)中椎弓根釘?shù)廊⊙M(jìn)行骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）的分離培養(yǎng)及鑒定。取傳至第3代細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)。建立5個(gè)培養(yǎng)組：BMSCs單獨(dú)培養(yǎng)組，退變NPCs單獨(dú)培養(yǎng)組，正常NPCs單獨(dú)培養(yǎng)組，BMSCs與退變NPCs共培養(yǎng)組，BMSCs與正常NPCs共培養(yǎng)組。共培養(yǎng)7 d后，RT-PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞SOX-9、聚集蛋白聚糖Aggrecan與Ⅱ型膠原蛋白的mRNA表達(dá)。 結(jié)果 相較于BMSCs單獨(dú)培養(yǎng)組，共培養(yǎng)組BMSCs的SOX-9、Aggrecan與Ⅱ型膠原蛋白的mRNA表達(dá)均有明顯增加（P ＜ 0.05）。同時(shí)與BMSCs與正常NPCs共培養(yǎng)組相比，BMSCs與退變NPCs共培養(yǎng)組BMSCs的SOX-9、Aggrecan與Ⅱ型膠原蛋白的mRNA表達(dá)均有明顯增加（P ＜ 0.05）。與退變NPCs單獨(dú)培養(yǎng)組相比，共培養(yǎng)組退變NPCs的SOX-9、Aggrecan與Ⅱ型膠原蛋白的mRNA表達(dá)均明顯增加（P ＜ 0.01）。與正常NPCs單獨(dú)培養(yǎng)組相比，共培養(yǎng)組正常NPCs的SOX-9、Aggrecan與Ⅱ型膠原蛋白的mRNA表達(dá)均明顯增加（P ＜ 0.01）。 結(jié)論 BMSCs與NPCs共培養(yǎng)時(shí)的相互作用能促使BMSCs向類髓核表型分化，較之正常NPCs，退變NPCs與BMSCs共培養(yǎng)時(shí)能更明顯地促進(jìn)BMSCs向類髓核表型分化。同時(shí)BMSCs對(duì)NPCs的調(diào)節(jié)作用能促進(jìn)其特征性相關(guān)基因表達(dá)，與退變NPCs共培養(yǎng)時(shí)，這一效應(yīng)依然明顯。

[關(guān)鍵詞] 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；髓核細(xì)胞；共培養(yǎng)

[中圖分類號(hào)] R681.5；R329 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2012）06-0006-04

Co-culture induces human bone marrow-derived mesenchymal stem cell differentiation and modulation of the nucleus pulposus cell phenotype

ZHAO Chencheng1 MA Xun2 ZHANG Ming1 MAN Xiaoxu1 GUAN Xiaoming1

1.Department of Orthopaedics， the Second Hospital of Shanxi Medical University， Taiyuan 030001， China; 2.Department of Orthopaedics， Shanxi Academy of Medical Sciences Shanxi Great Hospital， Taiyuan 030001， China

[Abstract] Objective To investigate the interaction between human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BMSCs) and nucleus pulposus cells (NPCs) from both nondegenerate and degenerate discs during in vitro co-culture， and make a comparison. Methods The isolation and identification of BMSCs and NPCs were performed on bone marrow blood and nucleus pulposus from either disk degeneration patients or scoliosis patients. Five groups were designed as follows: A group (BMSCs group)， B group (degenerated NPCs group)， C group (nondegenerated NPCs group)， D group (BMSCs with degenerated NPCs co-cultured group) and E group (BMSCs with nondegenerated NPCs co-cultured group). The mRNA expressions of collagen Ⅱ， SOX-9 and aggrecan of these two types of cells were assessed using quantitative real-time PCR after 7 days. Results Compared with A group， the mRNA expressions of collagenⅡ， SOX-9 and aggrecan significantly upregulated in D and E groups. Compared with E group， the mRNA expression was upregulated in D group (P ＜ 0.05). Compared with B group， the mRNA expression of D group increased (P ＜ 0.01). Compared with C group， the mRNA expression of E group also increased (P ＜ 0.01). Conclusion During co-culture process， the interaction between BMSCs and NPCs can stimulate BMSCs and differentiate to a NP-like phenotype; Compared with nondegenerate NPCs， co-culture with degenerate NPCs can more significantly stimulate BMSCs differentiating to a NP-like phenotype. At the same time， BMSCs can regulate both nondegenerate and degenerate NPCs.

[Key words] Bone mesenchymal stem cells; Nucleus pulposus cells; Co-culture

椎間盤退變導(dǎo)致的腰痛是骨科的多發(fā)病，臨床常用的保守治療以及手術(shù)治療能夠緩解癥狀，但并不能改變椎間盤退變的事實(shí)。目前，針對(duì)椎間盤退變的生物學(xué)修復(fù)的細(xì)胞移植治療為治療這一疾病提供了一種新的思路[1]。其中，通過移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs）來延緩、修復(fù)椎間盤退變成為研究熱點(diǎn)[2]。有學(xué)者已經(jīng)在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中證明，體外共培養(yǎng)時(shí)，BMSCs和髓核細(xì)胞（nucleus pulposus cells，NPCs）的相互作用能促使BMSCs向類髓核表型分化同時(shí)促進(jìn)NPCs分化增殖和特征性物質(zhì)表達(dá)。這為BMSCs移植治療椎間盤退變提供了理論依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)將人BMSCs分別與人正常及退變NPCs進(jìn)行共培養(yǎng)，研究其類髓核分化效應(yīng)及其對(duì)NPCs表型的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)主要儀器及試劑：5%CO2培養(yǎng)箱（Heraeus）、倒置相差顯微鏡（Olympus）、超凈工作臺(tái)（上海凈化儀器廠）、Transwell小室（Corning）、PCR儀（Applied Biosystems公司7300）、FC500流式細(xì)胞儀（Beckman Coulter）；Ⅱ型膠原酶（Solarbio）、胰蛋白酶（Solarbio）、DMEM培養(yǎng)基（杭州四季青）、胎牛血清（杭州四季青）、PCR檢測(cè)試劑盒（上海生工）。

材料：人退變椎間盤髓核組織來源于腰椎退變手術(shù)患者，正常椎間盤髓核組織來源于先天性脊柱側(cè)彎手術(shù)患者，患者及其家屬知情同意。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 人NPCs的獲得、培養(yǎng)及鑒定 無菌條件下取出髓核組織，2 h內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室，PBS液洗凈，超凈工作臺(tái)下將髓核與纖維環(huán)及纖維環(huán)交界區(qū)用眼科剪分離，將髓核剪碎至組織塊＜1 mm×1 mm×1 mm，0.2%Ⅱ型膠原酶37℃水浴箱中消化2 h，PBS洗滌2次，0.25%胰蛋白酶溶液37℃水浴箱中消化15 min，PBS洗滌3次。用添加20%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液終止消化，沖洗3次，加入培養(yǎng)液均勻吹打，計(jì)數(shù)后將細(xì)胞接種于底面積為25 cm2的培養(yǎng)瓶中，在37℃、體積分?jǐn)?shù)5%的CO2培養(yǎng)箱中開始原代培養(yǎng)，隔2～3 d換液。原代培養(yǎng)細(xì)胞達(dá)到90%融合時(shí)，加入0.25%胰酶，加入少許培養(yǎng)液，用吸管吹打瓶壁細(xì)胞，使之脫落形成細(xì)胞懸液。計(jì)數(shù)后將懸液按1∶2分裝入培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。選取原代細(xì)胞行細(xì)胞爬片，進(jìn)行Ⅱ型膠原免疫組化染色鑒定。

1.2.2 人BMSCs的獲得、培養(yǎng)及鑒定 將采集的骨髓血加入等體積的添加20%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，接種于底面積為25 cm2的培養(yǎng)瓶中，在37℃、體積分?jǐn)?shù)5%的CO2培養(yǎng)箱中開始原代培養(yǎng)，每隔3 d半量換液。倒置相差顯微觀察。1周左右觀察到細(xì)胞開始貼壁生長(zhǎng)。此后每2～3天全量換液。待細(xì)胞接近90%融合后，以PBS沖洗2次，加入0.25%胰酶/0.02% EDTA溶液2 mL，靜置于37℃培養(yǎng)箱孵育5 min，見細(xì)胞由梭形回縮為球形時(shí)加入FBS 2 mL終止消化，PBS洗滌離心2次，加入完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞后1:3傳代到新的培養(yǎng)瓶中。選取第3代細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)鑒定細(xì)胞表面標(biāo)志物CD44、CD14。

1.2.3 新式分層共培養(yǎng)模型的建立 取上述培養(yǎng)至第3代的BMSCs，接種于去掉掛臂的Transwell 6孔板底部（1×104個(gè)/cm2），將第3代NPCs接種于去掉掛臂的Transwell 6孔板上層插槽中（1×104個(gè)/cm2），中間以聚碳酸酯透水膜（孔隙0.4 μm）分隔（使細(xì)胞不能通過，但BMSCs分泌的細(xì)胞因子可以通過半透膜）。同時(shí)取普通6孔培養(yǎng)板，設(shè)置BMSCs單獨(dú)培養(yǎng)組及NPCs單獨(dú)培養(yǎng)組，各組細(xì)胞接種密度均為1×104/cm2。37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，均培養(yǎng)至7 d。每3天換液1次。

1.2.4 RT-PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞相關(guān)基因的mRNA表達(dá) 收集各孔細(xì)胞，以Trizol試劑裂解細(xì)胞。抽提細(xì)胞總RNA，測(cè)定RNA濃度，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。RT-PCR分別擴(kuò)增SOX-9、聚集蛋白聚糖Aggrecan與Ⅱ型膠原蛋白的mRNA表達(dá)量，引物由上海生工設(shè)計(jì)，序列如下：Ⅱ型膠原上游序列：5’-GCTCGCACCTGCAGAGACCTG-3’，下游序列：5’-GTCCACACCGAATTCCTGCTCG-3’；聚集蛋白聚糖上游序列：5’-ATGCCCAAGACTACCAGTGG-3’，下游序列：5’-TCCTGGAAGCTCTTCTCAGT-3’；SOX-9上游序列：5’-TCCTCAGGCTTTGCGATTT-3’，下游序列：5’-TGCTCGGGCACTTATTGG-3’；β-actin上游序列：5’-GGACTCGTCATACTCCTGCTTG-3’，下游序列：5’-GGAAATCGTGCGTGACATTAAG-3’。按照上海生工熒光定量PCR試劑盒說明進(jìn)行兩步法PCR擴(kuò)增：stage1預(yù)變性，Reps：1，95℃ 30 s；stage2 PCR反應(yīng)，Reps：40，95℃ 5 s，60℃ 30 s。

1.3 主要觀察指標(biāo)

①NPCs和BMSCs的形態(tài)觀察及BMSCs細(xì)胞表面標(biāo)志物的流式鑒定及NPCs Ⅱ型膠原免疫組化染色鑒定。②RT-PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞SOX-9、聚集蛋白聚糖Aggrecan與Ⅱ型膠原蛋白的mRNA表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)用（x±s）表示，多個(gè)樣本均數(shù)兩兩比較使用LSD-t檢驗(yàn)，P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs形態(tài)學(xué)觀察及鑒定結(jié)果

細(xì)胞培養(yǎng)1周左右開始觀察到貼壁生長(zhǎng)，貼壁細(xì)胞呈現(xiàn)長(zhǎng)條形、漩渦形（圖1）。取第3代細(xì)胞行流式細(xì)胞術(shù)鑒定細(xì)胞表面標(biāo)志物，呈現(xiàn)高表達(dá)CD44、低表達(dá)CD14，符合BMSCs細(xì)胞特點(diǎn)[3]。取第3代細(xì)胞共培養(yǎng)7 d后，可觀察到共培養(yǎng)組BMSCs較單獨(dú)培養(yǎng)組細(xì)胞密度明顯變大，細(xì)胞間伸出偽足相互接觸。

2.2 NPCs形態(tài)學(xué)觀察及鑒定結(jié)果

細(xì)胞培養(yǎng)3 d左右可見貼壁細(xì)胞。貼壁細(xì)胞呈現(xiàn)梭型、多角形（圖2）。取第3代細(xì)胞行Ⅱ型膠原染色，結(jié)果陽性，符合NPCs特點(diǎn)[4]。取第3代細(xì)胞共培養(yǎng)7 d后，可觀察到共培養(yǎng)組細(xì)胞在細(xì)胞密度上明顯變大，細(xì)胞聚集生長(zhǎng)，細(xì)胞間伸出偽足相互接觸。

2.3 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

共培養(yǎng)7 d后，與BMSCs單獨(dú)培養(yǎng)組相比，共培養(yǎng)組的BMSCs的SOX-9、聚集蛋白聚糖Aggrecan與Ⅱ型膠原蛋白的mRNA表達(dá)明顯增強(qiáng)（P ＜ 0.05），其中相較于BMSCs與正常NPCs共培養(yǎng)組，BMSCs與退變NPCs共培養(yǎng)組中BMSCs的SOX-9、聚集蛋白聚糖Aggrecan與Ⅱ型膠原蛋白的mRNA表達(dá)增強(qiáng)（P ＜ 0.05）（圖3）。與NPCs單獨(dú)培養(yǎng)組相比，共培養(yǎng)組NPCs的SOX-9、聚集蛋白聚糖Aggrecan與Ⅱ型膠原蛋白的mRNA表達(dá)明顯增強(qiáng)（P ＜ 0.01）（圖4）。

3 討論

椎間盤退變首先是髓核細(xì)胞的退行性改變，表現(xiàn)為髓核細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)Ⅰ、Ⅲ膠原增加，蛋白聚糖和Ⅱ型膠原等物質(zhì)減少，髓核細(xì)胞數(shù)減少且被成纖維細(xì)胞替代，從而導(dǎo)致含水量降低，椎間盤功能減弱、喪失[5]。于是椎間盤退變的細(xì)胞治療主要集中在植入新細(xì)胞替代已退變髓核細(xì)胞的功能或修復(fù)原有髓核細(xì)胞的退變。BMSCs具有多向分化潛能，可以分化為成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、心肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等[6]，同時(shí)具有低免疫原性[6]及容易獲得、擴(kuò)增的特性。這些特性使得BMSCs成為移植治療椎間盤退變理想的種子細(xì)胞。目前，體外研究多集中在摸索和研究刺激誘導(dǎo)條件，使人或動(dòng)物的BMSCs向NPCs分化。其中研究BMSCs與椎間盤細(xì)胞共同培養(yǎng)，成為研究熱點(diǎn)。

通過共培養(yǎng)來研究BMSCs修復(fù)退變椎間盤主要集中在兩方面，其一為BMSCs對(duì)NPCs的調(diào)節(jié)作用的研究。共培養(yǎng)時(shí)，BMSCs對(duì)NPCs在細(xì)胞增殖、分化過程中起著重要的調(diào)控作用。Yamamoto Y等[7]將兔BMSCs與NPCs直接接觸共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)后NPCs的細(xì)胞增殖、DNA合成、蛋白聚糖合成都較單獨(dú)培養(yǎng)的NPCs有明顯的上調(diào)。Richardson SM等[8]將人BMSCs與NPCs共同培養(yǎng)也獲得了相似的結(jié)果。但由于細(xì)胞混合培養(yǎng)，純化分選困難，會(huì)對(duì)結(jié)果造成干擾。方忠等[9]將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和正常髓核細(xì)胞分層共培養(yǎng)，同樣證明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能促進(jìn)髓核細(xì)胞增殖分化。以上結(jié)果表明BMSCs能通過對(duì)NPCs的調(diào)節(jié)作用，在椎間盤修復(fù)中起作用。但究竟BMSCs是通過何種途徑對(duì)NPCs發(fā)揮其調(diào)節(jié)作用，目前尚無明確結(jié)論。其二為對(duì)BMSCs具有潛在的分化為類髓核細(xì)胞能力的研究。Sakai D等[10]把分離培養(yǎng)的BMSCs種植到Atelocollagen凝膠支架上，再自體移植到椎間盤組織中，結(jié)果顯示移植后細(xì)胞存活并成功繁殖，發(fā)育成與椎間盤細(xì)胞相似的紡錘形細(xì)胞。將BMSCs與正常NPCs體外共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)[8]，BMSCs中髓核標(biāo)記基因（SOX-9、aggrecan、Ⅱ型膠原等）表達(dá)顯著增加，提示共培養(yǎng)時(shí)的相互作用能作用于BMSCs，使其發(fā)生類髓核分化，從而可能通過替代原有椎間盤細(xì)胞的作用來延緩以及修復(fù)椎間盤退變。但是目前的共培養(yǎng)研究多是正常NPCs與BMSCs共培養(yǎng)的研究。在臨床實(shí)際應(yīng)用中，均是對(duì)處于不同退變程度的椎間盤進(jìn)行移植修復(fù)，髓核細(xì)胞的生物特性已經(jīng)發(fā)生改變，BMSCs能否通過對(duì)NPCs的調(diào)節(jié)作用及實(shí)現(xiàn)類髓核分化修復(fù)退變椎間盤需要進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)分別選用人正常以及退變的NPCs與BMSCs做共培養(yǎng)研究，更具有臨床意義。結(jié)果顯示BMSCs與退變NPCs共培養(yǎng)時(shí)依然有明顯的調(diào)節(jié)作用以及類髓核分化效應(yīng)，說明對(duì)于退變的椎間盤組織而言，基于細(xì)胞移植的治療依然有效。這對(duì)于臨床上開展通過BMSCs移植治療椎間盤退變具有一定的指導(dǎo)意義。此外，與未退變的NPCs與BMSCs的共培養(yǎng)進(jìn)行比較，結(jié)果顯示退變的NPCs與BMSCs共培養(yǎng)時(shí)，其促進(jìn)BMSCs向類髓核表型分化的能力更強(qiáng)，這進(jìn)一步加強(qiáng)了對(duì)于臨床上開展通過BMSCs移植治療椎間盤退變的理論支持，同時(shí)這可能對(duì)于臨床上將來開展BMSCs細(xì)胞移植的移植時(shí)機(jī)選擇有一定意義。

本實(shí)驗(yàn)選用去掉掛臂的Transwell小室作為共培養(yǎng)的載體，該系統(tǒng)上層插槽底膜為聚碳酸酯透水膜（孔隙0.4 μm），這使BMSCs分泌的一些因子能夠通過半透膜起作用，同時(shí)半透膜的存在又能將兩種細(xì)胞分隔開來，利于細(xì)胞的觀察以及之后細(xì)胞的分離和結(jié)果的檢測(cè)。而去掉掛臂的Transwell小室較傳統(tǒng)Transwell小室能夠更有效地模擬椎間盤內(nèi)的微環(huán)境，能使共培養(yǎng)的細(xì)胞之間充分接觸，從而使細(xì)胞間的相互作用更加明顯。

本實(shí)驗(yàn)所選取的樣本例數(shù)偏少，大樣本量的研究應(yīng)該更具說服力。對(duì)于共培養(yǎng)時(shí)BMSCs與NPCs之間相互作用的具體機(jī)制并不清楚，接下來我們會(huì)針對(duì)細(xì)胞間相互作用的具體機(jī)制進(jìn)行研究。

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（收稿日期：2011-12-19）