PCNA、Caspase-3和Bcl-2在不同類型IgA腎病中的表達(dá)及意義

[摘要] 目的 觀察增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）和B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）在不同病理學(xué)類型IgA腎病（IgAN）中的表達(dá)，并探討其意義及與患者腎功能臨床指標(biāo)之間的關(guān)系。 方法 采用免疫組化法測(cè)定54例IgAN患者腎組織PCNA、Caspase-3和Bcl-2的水平，收集患者血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）、24 h尿蛋白定量的臨床檢測(cè)結(jié)果。 結(jié)果 （1）IgA腎病患者腎組織中PCNA的表達(dá)從低到高依次為Ⅰ級(jí)（0.09±0.03）、Ⅱ級(jí)（0.12±0.02）、Ⅴ級(jí)（0.13±0.01）、Ⅲ級(jí)（0.28±0.08）、Ⅳ級(jí)（0.54±0.03），其中Ⅰ級(jí)與Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ級(jí)間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.01）；Caspase-3與Bcl-2的表達(dá)隨級(jí)別增加而逐漸增高：Caspase-3的表達(dá)依次為Ⅰ級(jí)（0.08±0.01）、Ⅱ級(jí)（0.11±0.02）、Ⅲ級(jí)（0.13±0.08）、Ⅳ級(jí)（0.20±0.01）、Ⅴ級(jí)（0.35±0.01），其中Ⅰ級(jí)與其他各級(jí)間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.01）。Bcl-2的表達(dá)依次為Ⅰ級(jí)（0.09±0.02）、Ⅱ級(jí)（0.11±0.01）、Ⅲ級(jí)（0.15±0.01）、Ⅳ級(jí)（0.29±0.01）、Ⅴ級(jí)（0.32±0.01），其中Ⅰ、Ⅱ級(jí)與Ⅲ～Ⅴ級(jí)間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.01）。三種蛋白Ⅲ、Ⅳ級(jí)的表達(dá)為PCNA＞ Bcl-2＞Caspase-3，Ⅴ級(jí)的表達(dá)為Caspase-3＞Bcl-2＞PCNA，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.01）。（2）Scr、BUN、24 h尿蛋白定量從Ⅰ級(jí)到Ⅴ級(jí)均逐漸增高，Scr的水平依次為65.08±14.11、81.53±21.71、133.86±69.36、147.56±52.69、280.03±137.81，其在Ⅴ級(jí)的水平與其他各組間比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.01）；BUN的水平依次為4.77±1.39、6.16±2.48、6.97±3.60、9.44±2.80、13.30±6.32，其Ⅴ級(jí)水平與Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級(jí)間比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.01）；24 h尿蛋白定量的水平依次為0.84±0.33、2.50±1.08、3.35±0.82、3.54±0.77、4.66±1.42，其Ⅰ級(jí)的水平與其他各級(jí)間及Ⅴ級(jí)與Ⅱ、Ⅲ級(jí)間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.01）。（3）PCNA、Caspase-3和Bcl-2的表達(dá)與Scr、BUN、24 h尿蛋白定量均呈正相關(guān)（P ＜ 0.01），PCNA的表達(dá)與Caspase-3呈正相關(guān)（P ＜ 0.05）。 結(jié)論 PCNA、Caspase-3和Bcl-2隨著IgAN Ⅰ~Ⅴ級(jí)表達(dá)水平逐漸增加，提示IgAN病程進(jìn)展及腎功能的損傷可能與細(xì)胞凋亡增殖失衡有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] IgA腎病；凋亡；PCNA；Caspase-3；Bcl-2

[中圖分類號(hào)] R692.310 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2012）06-0001-03

Expression and its significance of Caspase-3、Bcl-2 and PCNA in the various pathological type of IgA nephropathy

WANG Chenjing WEI Jianping ZHANG Xiaoqin GAO Lifang

Department of Pathology， the Second Hospital of Shanxi Medical University， Taiyuan 030001， China

[Abstract] Objective To investigate the expression and significance of Caspase-3、Bcl-2 and PCNA in the various pathological type of IgA nephropathy（IgAN）， and discuss the relationship between clinical index and Caspase-3、Bcl-2 and PCNA. Methods The expression of PCNA、Caspase-3 and Bcl-2 in 54 cases of renal setions was examined by immunohistochemistry. Collected the results of clinical indexes：serum creatinine（Scr）、urea nitrogen（BUN）、24 hour urine protein quant. Results （1）In IgA renal tissue the expression of PCNA from low to high were levelⅠ（0.09±0.03）、levelⅡ（0.12±0.02）、levelⅤ（0.13±0.01）、level Ⅲ（0.28±0.08）、level Ⅳ（0.54±0.03）， between grade Ⅰ and grade Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ， the expression of PCNA were both significantly different （P < 0.01）. The expression of Caspase-3 and Bcl-2 were both gradely increased followed the level of IgAN. The expression of Caspase-3 in turn were 0.08±0.01、0.11±0.02、0.13±0.08、0.20±0.01、0.35±0.01， between level Ⅰand other levels which were both statistically significant （P < 0.01）. The expression of Bcl-2 in turn were 0.09±0.02、0.11±0.01、0.15±0.01、0.29±0.01、0.32±0.01， between grade Ⅰ、Ⅱand grade Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ which were both statistically significant （P < 0.01）. （2）From grade Ⅰ to Ⅴ， Scr、 BUN、 24 hour urine protein quant were gradually increased， Scr levels were 65.08±14.11、81.53±21.71、133.86±69.36、147.56±52.69、280.03±137.81， its level between gradeⅤand other groups were significantly different （P < 0.01）; BUN levels were 4.77±1.39、6.16 ±2.48、6.97±3.60、9.44±2.80、13.30±6.32， its level between grade Ⅴ and grade Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ were significantly different （P < 0.01）; 24 hour urine protein quant levels were 0.84±0.33、2.50±1.08、3.35±0.82、3.54±0.77、4.66±1.42， its level between grade Ⅰ and other levels and between grade Ⅴ and gradeⅡ、Ⅲ were all significantly different （P < 0.01）. （3）The expression of PCNA、Caspase-3 and Bcl-2 were positively correlated with the level of Scr、BUN and 24 hour urine protein quant （P < 0.01）. The expression of PCNA was positively correlated with Caspase-3. Conclusion The expressions of PCNA、Caspase-3 and Bcl-2 are gradually increased with ⅠtoⅤIgA nephropathy. The progression of IgAN and the damage of renal function may be connected with the imbalance between proliferation and apoptosis.

[Key words] IgA nephropathy; Apoptosis; PCNA; Caspase-3; Bcl-2

IgA腎病（IgA nephropathy，IgAN）是一組以腎小球系膜區(qū)IgA沉積、同時(shí)伴系膜細(xì)胞增生和系膜基質(zhì)擴(kuò)張為主要病理改變的原發(fā)性腎小球腎炎。研究表明，不同病理學(xué)類型IgAN由于病理改變不同，表現(xiàn)出的細(xì)胞凋亡與增殖不同，凋亡機(jī)制的反應(yīng)性存在著明顯的差異[1]。但PCNA、Caspase-3和Bcl-2與不同類型IgAN關(guān)系的研究報(bào)道較少。本研究觀察PCNA、Caspase-3和Bcl-2在不同病理類型IgA腎病的變化，并探討其意義及與患者腎功能臨床指標(biāo)間的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

54例IgAN患者腎活檢標(biāo)本均選自山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院病理科2006年7月～2010年7月病理科存檔資料。其中男38例，女16例，平均年齡31.5歲。均除外紫癜性腎炎、狼瘡腎炎、乙肝病毒相關(guān)性腎炎及肝病性腎小球硬化癥等繼發(fā)性腎病。所有標(biāo)本均行光鏡、直接免疫熒光和透射電鏡檢查。光鏡經(jīng)常規(guī)石蠟組織切片，行蘇木素-伊紅（HE）、過(guò)碘酸雪夫反應(yīng)（PAS）、過(guò)碘酸六胺銀染色（PASM）及馬松染色（Masson），直接免疫熒光檢查采用OCT 包埋，冰凍切片觀察IgG、IgM、IgA、C3、C1q、FRA；電鏡檢查經(jīng)戊二醛固定，制作切片并觀察。按照1997年Hass分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)IgAN進(jìn)行病理組織學(xué)分級(jí)：輕微病變型（Ⅰ級(jí)）9例；局灶節(jié)段性腎小球硬化樣型（Ⅱ級(jí)）12例；局灶增生型（Ⅲ級(jí)）12例；彌漫增生型（Ⅳ級(jí)）11例；進(jìn)行性慢性腎炎型（Ⅴ級(jí)）10例。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 腎組織PCNA、Caspase-3和Bcl-2的檢測(cè) 將存檔的石蠟包埋標(biāo)本常規(guī)制片，采用免疫組化染色二步法染色。每例切片隨機(jī)選取5個(gè)200倍視野下分析，所有經(jīng)免疫組化染色的結(jié)果用Image-Pro plus（IPP）圖像處理系統(tǒng)測(cè)定腎小球Caspase-3、Bcl-2的平均光密度，以反映Caspase-3、Bcl-2的表達(dá)量。PCNA的表達(dá)情況用球內(nèi)陽(yáng)性胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)（%）表示。PCNA、Caspase-3和Bcl-2抗體均購(gòu)于武漢博士德生物技術(shù)開發(fā)有限公司，增強(qiáng)劑、二抗、DAB顯色試劑盒購(gòu)于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.2.2 臨床指標(biāo)的檢測(cè) 包括Scr、BUN、24 h尿蛋白定量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)測(cè)定值計(jì)量資料以（x±s）表示，多組間比較用單因素方差分析（ANOVA），組間兩兩比較用Bonferroni法。各指標(biāo)間相關(guān)性采用Spearson相關(guān)性分析。全部數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 13.0軟件包分析， P < 0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同病理學(xué)類型IgA腎病中PCNA、Caspase-3和Bcl-2的表達(dá)

見表1。表1顯示，PCNA、Caspase-3在Ⅰ級(jí)與Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ級(jí)間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.01）。Bcl-2在Ⅰ級(jí)、Ⅱ級(jí)與Ⅲ～Ⅴ級(jí)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.01）。在Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ級(jí)的三種蛋白表達(dá)間也均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.01）。IgAN腎組織內(nèi)PCNA、Caspase-3和Bcl-2均主要表達(dá)于腎小球系膜細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。PCNA為細(xì)胞核陽(yáng)性，Caspase-3陽(yáng)性部位為細(xì)胞核或細(xì)胞漿，Bcl-2陽(yáng)性定位于細(xì)胞漿。

2.2 不同病理學(xué)類型IgA腎病臨床指標(biāo)的比較

見表2。表2顯示，Scr在Ⅴ級(jí)的水平與其他各級(jí)間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.01）；BUN在Ⅴ級(jí)的水平與Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級(jí)間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.01）；24 h尿蛋白定量在Ⅰ級(jí)的水平與其他各組間及在Ⅴ級(jí)與Ⅱ、Ⅲ級(jí)間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.01）。

2.3 三種蛋白及腎功能臨床指標(biāo)間的相關(guān)性

見表3。表3顯示 PCNA、Caspase-3和Bcl-2的表達(dá)與Scr、BUN、24 h尿蛋白定量間均呈正相關(guān)。

2.4 PCNA、Caspase-3、Bcl-2表達(dá)之間的相關(guān)性

見表4。表4顯示，PCNA的表達(dá)與Caspase-3呈正相關(guān)。

3 討論

增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）是反映細(xì)胞增殖活性的一項(xiàng)良好指標(biāo)，它與DNA聚合酶δ結(jié)合，以引導(dǎo)完成DNA的復(fù)制[2]，其存在直接表明細(xì)胞處于增殖周期，從而有助于了解各種腎臟疾病的發(fā)病過(guò)程。

Sebo等[3]認(rèn)為腎小球增殖指數(shù)與腎小球組織病變程度有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，在輕微病變型（Ⅰ級(jí)）PCNA表達(dá)較少，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級(jí)其表達(dá)逐漸增多，而到進(jìn)行性慢性腎炎型（Ⅴ級(jí)）由于過(guò)度的增殖導(dǎo)致纖維化和瘢痕形成，腎小球細(xì)胞增殖能力減弱，其表達(dá)又明顯減少，提示IgAN腎小球細(xì)胞增殖程度隨腎臟病變加重進(jìn)行性增加。這與Sebo的觀點(diǎn)類似。

Caspase-3是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行者[4]。大多數(shù)觸發(fā)細(xì)胞凋亡的因素最終均需要通過(guò)Caspase-3介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[5]。本研究結(jié)果顯示，Caspase-3隨著病變程度加重，其表達(dá)逐漸增高，Ⅰ級(jí)與其他各級(jí)間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。Caspase-3的表達(dá)與Scr、BUN、24 h尿蛋白定量均呈正相關(guān)（P ＜ 0.01），與PCNA的表達(dá)也呈正相關(guān)，表明Caspase-3可能參與了IgAN的凋亡過(guò)程，且隨著病變加重、腎功能降低、腎小球系膜細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞增殖增多，其觸發(fā)凋亡的作用也逐漸增強(qiáng)，以平衡腎小球細(xì)胞數(shù)，防止腎小球細(xì)胞過(guò)度增殖。

Bcl-2是Bcl-2蛋白質(zhì)家族中抗凋亡的成員之一，研究認(rèn)為，Bcl-2 可通過(guò)抑制內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶活性，阻止細(xì)胞色素C、黃素蛋白（AIF）從線粒體釋放入細(xì)胞質(zhì)，使凋亡效應(yīng)蛋白酶鏈 Caspase-3 不能激活以及抗氧化活性等機(jī)制發(fā)揮抑制的凋亡作用[6]。本研究結(jié)果顯示，Bcl-2的表達(dá)從Ⅰ級(jí)到Ⅴ級(jí)逐漸增高，且從Ⅱ級(jí)到Ⅳ級(jí)間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能是由于細(xì)胞凋亡不斷增多，Bcl-2也相應(yīng)啟動(dòng)其抑制凋亡的機(jī)制，以防止腎小球細(xì)胞過(guò)度凋亡。

在IgAN腎組織中Ⅰ、Ⅱ級(jí)PCNA、Caspase-3、與Bcl-2的表達(dá)無(wú)明顯差異，提示在病變初期細(xì)胞增殖、凋亡及抑制凋亡的機(jī)制處于相對(duì)平衡的狀態(tài)。在Ⅲ、Ⅳ級(jí)三種蛋白的表達(dá)為PCNA＞Bcl-2＞Caspase-3（P ＜ 0.01），提示在疾病進(jìn)展期細(xì)胞增殖多于凋亡，可能是由于雖然Caspase-3隨病變進(jìn)展凋亡機(jī)制增強(qiáng)，但Bcl-2蛋白抑制Caspase-3激活進(jìn)而抑制凋亡的作用也隨之增強(qiáng)，且抑制凋亡的作用大于激活從而導(dǎo)致腎小球細(xì)胞增殖與凋亡失衡。在Ⅴ級(jí)三種蛋白的表達(dá)為Caspase-3＞Bcl-2＞PCNA（P ＜ 0.01），可能提示在病變終末期Bcl-2抑制Caspase-3的作用減弱，導(dǎo)致Caspase-3過(guò)度激活進(jìn)而引起腎小球細(xì)胞的過(guò)度凋亡。過(guò)度的凋亡又導(dǎo)致瘢痕區(qū)內(nèi)腎小球固有細(xì)胞的消除，加重病情進(jìn)展[7]。亦有研究證實(shí)， 在多種動(dòng)物模型及 IgAN等臨床病例中均可觀察到腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞的過(guò)度凋亡與病程的進(jìn)展明顯相關(guān)[8]。但本實(shí)驗(yàn)中僅PCNA的表達(dá)與Caspase-3呈正相關(guān)，Bcl-2 與Caspase-3、PCNA并無(wú)相關(guān)性，所以在IgAN不同類型腎組織Caspase-3的激活是否受Bcl-2調(diào)節(jié)還需進(jìn)一步研究證實(shí)。

Scr是判斷腎臟疾病嚴(yán)重程度的可靠指標(biāo)。Li等[9]發(fā)現(xiàn)Scr與IgA腎病組織學(xué)分級(jí)呈正相關(guān)。Eiro等[10]認(rèn)為尿蛋白排泄量與腎小球和腎小管間質(zhì)組織學(xué)病變分級(jí)、Scr水平具有相關(guān)性，是IgA腎病進(jìn)展為ESRD的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。本研究結(jié)果顯示，Scr、BUN、24 h尿蛋白定量在IgANⅠ～Ⅴ級(jí)隨病理學(xué)分級(jí)均逐漸增高，且IgANⅠ～Ⅴ級(jí)PCNA、Caspase-3和Bcl-2的表達(dá)與Scr、BUN、24 h尿蛋白定量均呈正相關(guān)，與上述觀點(diǎn)相似。在Ⅰ、Ⅱ級(jí)，三種蛋白的表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示增殖與凋亡處于相對(duì)平衡狀態(tài)，腎功能損傷也相對(duì)較輕。在Ⅲ、Ⅳ級(jí)PCNA的表達(dá)明顯大于Caspase-3，提示過(guò)度增殖損傷了腎功能從而導(dǎo)致Scr、BUN、24 h尿蛋白定量水平升高，在Ⅴ級(jí)PCNA的表達(dá)明顯低于Caspase-3，提示過(guò)度凋亡進(jìn)一步加重了腎功能損傷。

總之，細(xì)胞增殖和凋亡間的相對(duì)平衡對(duì)維持正常細(xì)胞數(shù)有著重要的意義，過(guò)度增殖或過(guò)度凋亡都會(huì)造成IgAN病程進(jìn)展及腎功能的損傷。

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（收稿日期：2011-12-05）