刺藍抗疲勞口服液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

基金項目：湖南省科技廳基礎(chǔ)研究項目（2010FJ3105）

作者單位：410007 湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院（李康）；湖南省中醫(yī)藥研究院（李柯，陳丹，李若存）

通訊作者：李康

【摘要】 目的 建立刺藍抗疲勞口服液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法 采用薄層色譜法對處方中的刺五加、絞股藍、枸杞子、甘草進行鑒別；用高效液相色譜法對成品中紫丁香苷進行含量測定。結(jié)果 薄層色譜中能檢出刺五加、絞股藍、枸杞子、甘草；紫丁香苷在0.168～1.848 μg范圍呈良好的線性關(guān)系，r0.9997，平均回收率98.6%，RSD為2.43%。結(jié)論 所建立的方法能夠用于本品的質(zhì)量控制。

【關(guān)鍵詞】 刺藍抗疲勞口服液； 薄層色譜法； 紫丁香苷； 高效液相色譜法

Study on quality standard for Cilan Kangpilao oral liquid LI Kang，LI Ke，CHEN Dan，LI Ruo-cun.The First Affiliated Hospital in Hunan University of Traditional Medicine，Changsha 410007，China

【Abstract】 Objective To establish quality standards for Cilan Kanpilao oral liquid.Methods TLC on prescription of Acanthopanax， wolfberry fruit， Gynostemma， licorice for identification; HPLC method with the finished Syringin， determine the content of ginsenoside Rb1.Results Acanthopanax was detected by TLC， Gynostemma， wolfberry fruit， liquorice; Syringin in the range of 0.168～1.848 μg was a good linear relationship，r0.9997， average recovery was 98.6%， RSD 2.43%.Conclusion The method can be used for the quality control of Cilan Kangpilao oral liquid.

【Key words】 Cilan Kangpilao oral liquid; Thin layer chromatography; Syringin; High performance liquid chromatography

刺藍抗疲勞口服液由刺五加、絞股藍、枸杞子、甘草組方研制而成的中藥6類新藥，功能調(diào)補氣血、強精神、益氣力，用于術(shù)后疲勞綜合征，證屬氣血虧虛者。為了有效地控制其質(zhì)量，筆者采用薄層色譜法對制劑中的刺五加、絞股藍、枸杞子、甘草進行了鑒別，采用高效液相色譜法對刺五加的紫丁香苷進行了含量測定，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試劑

LC-10A高效液相色譜儀（日本島津）；C18（Column 200 mm×4.6 mm，5 μ）色譜柱（大連依利特分析儀器有限公司）；N2000數(shù)據(jù)處理軟件（浙江大學(xué)智能信息工程研究所）。刺五加對照藥材（批號:120991-200807）、人參二醇（批號：701-9405）、甜菜堿（批號:110894-200503）、甘草對照藥材（批號:120904-200511）、紫丁香苷對照品 （批號：111574-200502）均為中國藥品生物制品檢定所提供。甲醇（色譜純試劑，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司），水為重蒸餾水，其它試劑均為分析純（均為湖南匯虹試劑有限公司提供）。刺藍抗疲勞口服液（批號：20090908、20090914、20090916、20090918）由湖南省中醫(yī)藥研究院中藥研究所制劑室提供。

2 薄層色譜鑒別

2.1 刺五加鑒別 取三批樣品各10 ml，分別用正丁醇15 ml振搖提取，取正丁醇液層，蒸干，殘渣加甲醇1 ml溶解，作為供試品溶液。另取刺五加對照藥材3 g，加甲醇20 ml，加熱回流1 h，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1 ml溶解，作為對照藥材溶液。取除刺五加外的其余處方量藥材，按制備工藝方法制備缺刺五加的陰性樣品，按上述供試品溶液制備方法制成缺刺五加的陰性溶液。照薄層色譜法（《中國藥典》2005年版一部附錄Ⅵ B）試驗，吸取上述三種溶液各10 μl，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（6∶2∶1）的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干， 噴以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的斑點，陰性無干擾^［1～2］。

2.2 絞股藍的鑒別 取三批樣品各10 ml，分別用正丁醇15 ml振搖提取，取正丁醇液蒸干，殘渣加硫酸的45%乙醇溶液（7→100）15 ml，加熱回流1 h，揮去乙醇，用三氯甲烷10 ml振搖提取，分取三氯甲烷液，用水洗2次，每次10 ml，三氯甲烷液用適量無水硫酸鈉脫水，濾過，濾液蒸干，殘渣加無水乙醇1 ml溶解，作為供試品溶液。另取人參二醇對照品，加無水乙醇制成每1 ml含1 mg的溶液，作為對照品溶液。取除絞股藍外的其余處方量藥材，按制備工藝方法制備缺絞股藍的陰性樣品，按上述供試品溶液制備方法制成缺絞股藍的陰性溶液。照薄層色譜法（《中國藥典》2005年版一部附錄Ⅵ B）試驗，吸取上述三種溶液各10 μl，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-丙酮（2∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的斑點，陰性無干擾。

2.3 枸杞子的鑒別 取三批樣品各10 ml，分別置于已處理好的732陽型離子交換樹脂柱（1.0 cm×12 cm）上，用水洗至無色，再用5%氨水25 ml洗脫，收集洗脫液，水浴蒸干，殘渣加乙醇15 ml加熱提取，濾過，濾液蒸干，殘渣加乙醇1 ml溶解，作為供試品溶液。另取甜菜堿對照品，加乙醇制成每1 ml含3 mg的溶液，作為對照品溶液。取除枸杞子外的其余處方量藥材，按制備工藝方法制備缺枸杞子的陰性樣品，按上述供試品溶液制備方法制成缺枸杞子的陰性溶液。照薄層色譜法（《中國藥典》2005年版一部附錄Ⅵ B）試驗，吸取上述三種溶液各10 μl，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以丙酮-無水乙醇-鹽酸（10∶6∶1）為展開劑，預(yù)飽和30 min，展開，取出，晾干， 噴以新配制的改良碘化鉍鉀試液，用電吹風(fēng)加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的斑點，陰性無干擾。

2.4 甘草的鑒別 取三批樣品各5 ml，分別用乙酸乙酯10 ml振搖提取，提取液濃縮至1 ml，作為供試品溶液。另取甘草對照藥材0.5 g，加乙醇20 ml，加熱回流0.5 h，濾過，濾液蒸干，殘渣加水10 ml溶解，溶液按供試品方法制成2 ml對照藥材溶液。取除甘草外的其余處方量藥材，按制備工藝方法制備缺甘草的陰性樣品，按上述供試品溶液制備方法制成缺甘草的陰性溶液。照薄層色譜法（《中國藥典》2005年版一部附錄Ⅵ B）試驗，吸取上述三種溶液各10 μl，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水（15∶1∶1∶2）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的斑點，陰性無干擾。

3 含量測定

3.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-水（13∶87）為流動相；檢測波長為265 nm。理論板數(shù)按紫丁香苷峰計不低于2000。

3.2 對照品溶液的制備 取在110 ℃干燥至恒重的紫丁香苷對照品約8 mg，精密稱定，置50 ml量瓶中，加甲醇適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

3.3 供試品溶液的制備 精密量取本品2 ml，置10 ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用0.45 μm的微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

3.4 陰性溶液的制備 取除刺五加外的其余處方量藥材，按制備工藝方法制備缺刺五加的陰性樣品，按上述供試品溶液制備方法制成缺刺五加的陰性溶液。

3.5 干擾試驗 分別精密吸取對照品溶液、陰性溶液與供試品溶液各10 μl，注入液相色譜儀，測定，結(jié)果表明，陰性對照液在紫丁香苷保留時間處無吸收。

3.6 線性關(guān)系考察 精密吸取紫丁香苷（C0.168 mg/ml）對照品溶液1、3、5、7、9、11 μl進樣，測定其峰面積積分值。以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為：Y1E+06x+16149，r0.9997。結(jié)果表明紫丁香苷在0.168～1.848 μg范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

3.7 精密度試驗 精密吸取同一供試品溶液10 μl，重復(fù)進樣5次，測定其峰面積積分值計算RSD（%）為2.76%，說明精密度良好。

3.8 穩(wěn)定性試驗 分別精密吸取供試品溶液10 μl，于0、4、8、12、24 h進樣，測定其峰面積積分值。計算結(jié)果RSD（%）為3.24%，說明24 h內(nèi)供試液穩(wěn)定性良好。

3.9 重復(fù)性試驗 取同一批號樣品（批號：20090908）按上述條件，測定5次，測定其峰面積積分值。結(jié)果RSD（%）為3.60%，說明方法重復(fù)性好。

3.10 回收率試驗 精密量取已知含量為0.24 mg/ml（批號：20090908）樣品2 ml，共6份，分別精密加入紫丁香苷對照品溶液（0.168 mg/ml）3.0 ml，即0.504 mg，按含量測定項下的方法測定含量，計算回收率，平均值為98.60%， RSD為2.43%。結(jié)果見表1。

表1 回收率測定結(jié)果表

3.11 樣品含量測定取三批樣品， 按上述方法測定，結(jié)果見表2。

4 討論

4.1 薄層色譜鑒別 刺五加主要含苷類、黃酮類化合物，水溶性好，所以采用正丁醇萃取，濃縮后用甲醇溶解制成供試品溶液，與對照藥材對照，噴以10%硫酸乙醇溶液加熱顯色，

表2 樣品含量測定 （n3）

呈現(xiàn)一個藍色斑點，此斑點為紫丁香的特征斑點，經(jīng)三批樣品實驗觀察，陰性未見干擾，確認上述方法可行。

據(jù)文獻報道，從絞股藍中分離到80多種皂苷，其中皂苷Ⅲ、Ⅳ、Ⅷ、Ⅻ結(jié)構(gòu)和人參皂苷（gensenoside）-Rb1、Rb3、Rd、F2相同^［3］。在TLC法，擬采用Rb1化學(xué)對照品鑒別方中的絞股藍，但陰性有干擾，未獲成功；后經(jīng)反復(fù)試驗，確定了皂苷類成分水解，以人參二醇對照品鑒別方中絞股藍的方法，經(jīng)三批產(chǎn)品檢驗，表明本法成立。

枸杞子的薄層鑒別方法無論是枸杞子藥材，還是含枸杞子的制劑，往往采用在紫外燈下（365 nm）檢視東茛菪內(nèi)酯的方法，試驗過程中發(fā)現(xiàn)本品中刺五加所含的異秦皮啶與枸杞子所含的東茛菪內(nèi)酯因結(jié)構(gòu)類同，用多種展開系統(tǒng)未能達到理想的效果，且條件難控制，所以根據(jù)枸杞子所含甜菜堿的性質(zhì)，用本品上陽樹脂再用稀氨水洗脫，濃縮后用乙醇制成供試品溶液，經(jīng)缺枸杞子陰性對照，供試品色譜無干擾。

甘草主要含三萜皂苷、黃酮類化合物，采用乙酸乙酯直接萃取本品，得到甘草黃酮類化合物，供試品干凈。經(jīng)薄層試驗結(jié)果表明，其TLC分離效果好，斑點清晰。取缺甘草的陰性溶液，經(jīng)同法薄層分離，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上無相同顏色的斑點，說明缺甘草的陰性溶液無干擾。

4.2 含量測定 刺五加為方中君藥，功能為益氣健脾、補腎安神，所含的紫丁香苷為方中抗疲勞的主要有效成分之一。根據(jù)本制劑的特點，選用HPLC測定紫丁香苷含量作為本制劑的含量測定指標(biāo)，既可以較好控制制劑成品的質(zhì)量，也可以作為提取工藝的控制指標(biāo)。供試品溶液制備采用直接取樣甲醇稀釋的方法制備，目標(biāo)成分損失較少，穩(wěn)定性良好，且操作簡便，易于掌握^［4～6］。據(jù)文獻報道，紫丁香苷的HPLC含量測定多采用甲醇-水、乙腈-水、甲醇-水-冰醋酸等溶液配比作為流動相^［7］。本試驗結(jié)果顯示，以甲醇-水（13∶87）為流動相，紫丁香苷色譜峰能夠達到基線分離，重復(fù)性良好（RSD3.60%），刺五加陰性供試品無干擾，回收率達到97.6%。

參 考 文 獻

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（收稿日期：2011-04-01）

（本文編輯：陳丹云）