微環境對食管上皮細胞增殖分化的影響

【關鍵詞】 微環境； 食管上皮細胞

食管疾病的發生已成為危害人類健康的重要因素，每年有大量的患者需進行手術治療。而手術治療的主要方式多是切除食管或用自身的其他組織器官進行重建。其缺點是手術創傷大，操作復雜，術后并發癥多。因此組織工程食管日益顯現出其存在的必要性。組織工程食管的基本原理是將體外培養和擴增所得的自體細胞，種植在組織相容性好的可降解支架上，進行共同培養，再植入體內相應位置，逐步形成在結構功能上與自體組織相似的人工食管，但干細胞必須分化為上皮細胞才有價值。細胞的分化方向與微環境“壁龕”密切相關^［1］。微環境包括細胞因子、細胞外基質、生理激素、離子濃度、O₂濃度等。本文就微環境對組織工程中食管上皮細胞增殖分化的影響作一簡要綜述。

1 細胞因子的影響

1.1 血管內皮細胞生長因子 血管內皮細胞生長因子（vascular endothelial cell growth factor，VEGF）是一種分子量為40～45 kD的分泌性糖蛋白，編碼人類VEGF的基因位于染色體6p21.3上，該基因全長24 kb。體外實驗發現其對血管內皮的增殖，血管構建的作用較強，且特異性高，VEGF還可以增加血管內皮細胞的通透性^［2］。VEGF發揮作用主要依賴其受體的存在。其中VEGFR1和VEGFR2是血管內皮細胞的特異性酪氨酸激酶蛋白受體，而VEGFR3主要在淋巴管內皮細胞中表達^［3］。由此可見，VEGF在干細胞向食管上皮誘導分化過程中有一定的意義。首先，VEGF可以促進組織工程食管中微血管的生成，并增加其通透性；其次，促進淋巴管的形成。以上兩者的作用，創造出更接近于人體食管的微環境，有利于食管上皮細胞的增殖分化。

1.2 表皮生長因子 表皮生長因子（Epidermal Growth Factor，EGF）是一種廣泛存在于各種組織體液中的53個氨基酸組成的促有絲分裂的多肽，可促進多種細胞增殖，包括上皮細胞、間質細胞及神經干細胞等^［4］。EGF在體外可刺激角化細胞分裂，在體內可促進上皮的再生^［5］。許多文獻報道，干細胞向食管上皮分化中出現分化消失現象，原因可能與培養基血清中的轉移生長因子β（TGF-β）等因子抑制上皮細胞生長，但刺激成纖維細胞生長有關^［6］。成纖維細胞的大量產生有有利的一面，也可以消耗培養基中大量營養物質，從而抑制上皮細胞生長。劉洪清等^［7］采用添加EGF等細胞因子的方法，有效地促進食管上皮細胞增殖和傳代，有效抑制成纖維細胞生長。EGF與靶細胞表面的EGF受體結合后，能刺激受體自身磷酸化及細胞內其它蛋白質的酪氨酸磷酸化，進而激活蛋白激酶C和磷脂酶C，通過第二信使CAMP、Ca²⁺激活CAMP依賴的蛋白酶，使細胞核內組蛋白對DNA的阻遏作用解除，促使有絲分裂信號向細胞內傳遞，從而引起DNA合成細胞增殖^［8］。但不同濃度的EGF對BMSC促分化和促增殖的影響作用不同，其機理有待進一步研究。

1.3 轉移生長因子β 轉移生長因子β（ transforming growth factor-β，TGF-β）是一類多功能的細胞因子，參與多種細胞功能的調節，包括細胞增殖、分化、遷移，細胞外基質生成等。在干細胞向食管上皮分的過程中，TGF-β₁的突出作用是促使各種細胞外基質（extra cellular matrixc，ECM），如膠原蛋白、連接蛋白（fibronectin，FN）、層黏蛋白（laminin，LN）和蛋白多糖的合成，抑制這些蛋白的降解，從而增加ECM的沉積^［9］。TGF-β通過與細胞跨膜蛋白受體結合發揮其生物作用，其跨膜蛋白受體有三種亞型TGF-β RAⅠ、RⅡ、RⅢ。RI、RII有絲氨酸-蘇氨酸激酶活性，RⅢ可促進TGF-β與RI、RII結合^［10］。TGF-β₁另一重要作用是刺激成纖維上皮細胞的生長，但其機制說法尚不統一。被TGF-β₁刺激增生的成纖維細胞能促進食管上皮細胞增殖分化，有報道證實食管上皮細胞分層程度與加入成纖維細胞密度成正比^［11］。

1.4 胰島素樣生長因子-1 胰島素樣生長因子-1 （Insulin-like growth factor1，IGF-1）是一個重要的細胞增殖因子。在細胞周期中，一旦細胞進入G₁期，在其他生長因子缺乏的情況下，IGF-1可促進C增殖周期的完成^［12］。IGF-1的活性主要是由胰島素樣生長因子1受體（IGF-1R）介導的，即IGF-1R很大程度上與細胞增殖狀況有關^［13］。它的這種作用，在組織工程食管上皮細胞分化增殖中十分重要。組織工程食管上皮在體外培養時，必然存在與體內微環境的不同之處，缺乏某些細胞因子，IGF-1上述特點正好彌補了此種不足，值得關注的是IGF-1刺激細胞增生抑制凋亡，又是致食管癌的發生的重要因素。IGF-1活性主要由胰島素樣生長因子結合蛋白（IGFBPs）來調控，故對IGFBPs的研究也值得進一步深入研究。

1.5 堿性成纖維細胞生長因子 堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，BFGF），有研究表明，體積大于1 mm³的組織就需要血液供應。組織工程中食管上皮細胞體積巨大，需要充足的血供，BFGF表達與食管中微血管密度有關。BFGF是一種堿性多肽，在體內廣泛分布，是血管內皮細胞的有絲分裂素，它在體內可趨化血管內膜的各類細胞，并誘導這些細胞表達組織重建所需的血漿酶原激活劑等，通過刺激內膜各類細胞的增殖和遷移，誘導血管內皮細胞長入膠原基質中形成管腔，并促進神經元與新生血管的生長^［14］。BFGF在促進神經元生成的作用，為研究組織工程食管神經的重建提供了新的思路與著手點。

2 細胞外基質的影響

在組織工程食管中，高分了聚合材料結構和成分單一，不能同時提供食管上皮細胞生長的ECM。而種子細胞與ECM的黏附及相互作用是細胞分化增殖的基礎。故對ECM的研究，對組織工程食管上皮細胞分化增殖有重要意義。

2.1 膠原蛋白 研究發現Ⅰ型膠原主要存在于食管的黏膜下層及肌層內，Ⅲ型膠原主要存在于食管的外膜彈力纖維層和黏膜下^［15］。具有良好的生物相容性，極低的免疫原性，極強的促組織再生性^［16］。鮑春榮等^［10］用Ⅳ型膠原預涂材料表面，可有效地促進食管上皮細胞與支架的吸附和均勻分布。但在食管中各型膠原蛋白的比例關系及各型膠原如何特異性作用于食管的特定部位，還有待研究。

2.2 纖維連接蛋白 纖維連接蛋白（FN）是一組結構上類似、免疫源性相同的高分子糖蛋白，是體內重要的細胞外基質成份。它具有維持細胞正常形態參與細胞與細胞，細胞與基質間的粘連，促細胞生長，分化和增殖，調節細胞運動等功能，在正常食管上皮有表達^［17］。在組織上工程食管上皮細胞誘導過程中，利用其具有細胞間或細胞與其他細胞外基質間的橋蛋白作用，促進食管上皮細胞的粘附，構成其它增殖，分化的基礎。梁志剛等成功應用轉染Ad.FnCBD64的食管上皮細胞體外構建組織工程食管。證明了FN具有增強種子細胞黏附力的效果。但FN分子量大，在實際的使用中存在轉染種子細胞的困難，有待于尋找促進FN表達的實用性方法。

2.3 縫隙連接蛋白（Cx43） 縫隙連接蛋白（Connexins，Cx）的縫隙連接普遍存在于上皮細胞間，縫隙連接蛋白CX43表達與胚胎發育，細胞誘導，分化，生長調控有關^［18］。劉學紅等^［19］通過實驗證實，2～4個月CX43蛋白呈陽性或強陽性表達，4個月后呈弱陽性表達，推測在食管神經系統及微循環系統未完善時期，Cx43通過參與細胞間縫隙連接調控信息轉導及細胞的分化、增殖。在組織工程食管上皮細胞的培養中，誘導種子細胞向食管上皮細胞分化，利用Cx43特性促進分化增殖國內外尚無報道。筆者認為有待從實驗中得到求證。

3 性激素

從食管癌發生的性別差異，不難發現性激素可能參與了上皮細胞的增殖分化，但不論雌雄激素，發揮生理作用均與其受體密切相關，雌激素（ER）在胎兒食管→正常食管上皮兩者間出現到消失的規律。有學者認為最好的解釋是ER參與了食管上皮細胞的增殖分化。ER的作用機制為雌激素彌漫入細胞后，先與靶細胞漿中特異性受體結合，形成激素受體復合物，復合物進入細胞核內，加上共激活因子的作用與核內受體形成單二聚體，影響DNA轉錄生成新的mRNA，從而生成新的蛋白質，影響細胞生理功能，雄激素（AR）作用機制與ER相似。但在性激素影響下產生了何種蛋白質影響了生物學功能尚不清楚，且人體內雌雄激素間存在復雜的相互影響，不同性別個體間雌、雄激素迥然不同，所以性激素對組織工程食管上細胞的分化影響還有待進一步研究。

4 Ca²⁺濃度及O₂濃度的影響

4.1 Ca²⁺濃度與食管上皮細胞的增殖、分化密切相關 Ca²⁺濃度低于0.05 mmol/L時食管上皮細胞缺少橋粒，當Ca²⁺濃度大于等于0.05 mmol/L時角蛋白絲增加，橋粒出現。其機制可能為Ca²⁺充當第二信使激活CAMP依賴的蛋白激酶使細胞核內組蛋白對DNA的組合解除，促使有絲分裂信號向細胞內傳遞引起DNA合成，細胞增殖，并且整合素等粘附分子發揮作用也需要Ca²⁺的存在。

4.2 O₂濃度的影響 O₂濃度為微環境對組織工程食管上皮細胞分化的影響報道不一，有學者用CoCl₂誘導缺氧條件，發現隨缺氧時間延長，處于G₀/G₁期的細胞明顯增加，S期減少，由此認為，缺氧對細胞周期進行負調控^［20］。另一部分學者認為供氧不足，缺氧信號迅速傳至細胞核內啟動相關基因表達，以維持細胞和機體氧平衡，在這一過程中引起細胞的增殖分化，其中缺氧誘導因子-1（HIF-1）是影響調控的最主要因子。組織工程食管種子細胞在體外誘導分化過程中，O₂濃度必然高于正常處于體內的細胞，高O₂濃度的影響是有利于細胞增殖分化，還是不利于細胞增殖分化，有待于進一步研究。

今后，組織工程食管的研究，應深入研究微環境如何影響種子細胞向食管上皮細胞增生、分化，如何在體外模擬體內的微環境。在不久的未來，組織工程食管必將應用于臨床，給更多的患者減少病痛。

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（收稿日期：2011-07-04）

（本文編輯：車艷）