人臍血CD34⁺細胞體外誘導分化為樹突狀細胞及其擴增

【摘要】 目的 采用臍血CD34^{+>/sup>細胞在rhGM-CSF、rhTNF-α誘導下體外分化擴增為成熟樹突狀細胞。方法 應用CD34+>/sup>干細胞分選試劑盒以及免疫磁珠法從臍血中分離CD34+>/sup>細胞，用rhGM-CSF、rhTNF-α聯合誘導分化發育14 d，成為成熟DC，觀察細胞形態及檢測CD83分子表達。結果 50 ml臍帶血可分離出CD34+>/sup>細胞約1.1×106>/sup>，在rhGM-CSF、rhTNF-α誘導下CD34+>/sup>干細胞培養2周，約擴增10～20倍。CD34+>/sup>干細胞培養第3 d開始出現集落，第8～9天集落最大，CD34+>/sup>干細胞分化發育為有樹突狀突起的成熟DC，表面分子CD83陽性率為81.7%。結論 體外聯合運用rhGM-CSF、rhTNF-α，能夠成功誘導臍血CD34+>/sup>細胞分化為大量成熟的DCs。}

【關鍵詞】 樹突狀細胞； 臍血 CD34^{+>/sup>細胞； rhGM-CSF； rhTNF-α； 體外培養}

Induction and amplification of dendritic cells derived from human cord blood CD34^{+>/sup> cells in vitro CHEN Dong-xiao，ZHU Yuan-feng，WU Lin.The Second Affiliated Hospital of Shantou University Medical College，Shantou 515041，China}

【Abstract】 Objective The proliferation of human dendritic cells （DCs） from cord blood CD34^{+>/sup> cells induced by rhGM-CSF、rhTNF-α was observed.Methods CD34+>/sup> hematopoietic stem cells were isolated from healthy human cord blood using CD34+>/sup> progenitor cell isolated kit by a high-gradient magnetic cells sorting system（MACS）.The CD34+>/sup> cells were expanded with rhGM-CSF and rhTNF-α for 2 weeks. CD83 was analysed by means of flowcytometry.Results About 1.1×106>/sup> CD34+>/sup> cells were cultured， expanded and isolated from 50 ml cord blood:CD34+>/sup> stem cells were cultured in the presence of rhGM-CSF and rhTNF-α，and the cells were expanded 10～20-fold after 2 weeks. In the culture system，the small colony occur in the 3rd day，when expanded，the colony augment gradually and achieve the largest in the 8th to 9th day.About 81.7% expanded cells expessed CD83.Conclusion The in vitro culture system with rhGM-CSF and rhTNF-αcan effectively induce cord blood CD34+>/sup> cells to differentiate into dendritic cells.}

【Key words】 Dendritic cell； Cord blood； CD34^{+>/sup>cell； rhGM-CSF； rhTNF-α； Cell culture in vitro}

樹突狀細胞（dendritic cell，DC）是體內功能最強的一類專職性抗原遞呈細胞，同時也是唯一能直接激活初始型T細胞的抗原遞呈細胞，能通過MHC-Ⅰ將抗原遞呈給CD8+細胞，激活細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL），從而發揮特異性殺傷作用^［1］。無論是在機體免疫機制的研究還是應用于免疫治療，DCs一直是研究的熱點，特別是在腫瘤免疫中的地位越來越引起重視^［2，3］。采用外周血單個核細胞體外誘導分化的方法培養DCs最終收獲的DCs數量較少且活力和純度都不高。而臍血來源廣泛，取材方便，移植要求的HLA相合位點低，通過臍血CD34^{+>/sup>細胞分離擴增DC，有很大的實用價值。}

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 臍血 新鮮臍血50 ml，來源于汕頭大學醫學院第二附屬醫院健康產婦臍靜脈血，經肝素（20 U/ml）抗凝。

1.1.2 主要試劑 Min-MACS磁式細胞分選器及CD34^{+>/sup>細胞分離試劑盒，CD34＋細胞分離盒包括試劑A：非特異性抗體阻斷劑；試劑B：CD34+>/sup>磁珠單抗（Miltenyi Biotec公司）、rhGM-CSF（Sigma公司）、rhTNF-α（PePRO Tech Ec LTD）、FITC-CD83 micron-Ab1、FITC-mouse antihuman IGG1（e Bio Science公司）。淋巴細胞分離液及胎牛血清（天津TBD公司），DMEM/F12培養液（Gibico產品），BSA（Sigma公司）。}

1.2 方法

1.2.1 臍血CD34^{+>/sup>細胞的分選 新鮮抗凝臍血經等量D-Hanks液稀釋，再緩慢加于等量淋巴細胞分離液上，離心（2000 rpm，20 min，20 ℃），吸取白膜層細胞，分離出臍血單個核細胞。每108個單核細胞加入100 μl試劑A1，混勻后再加入100 μl試劑A2，6 ℃孵育30 min。采用Min-MACS磁式細胞分選器，經磁性細胞分離柱分選，收集CD34+>/sup>細胞，用臺盼藍染色并細胞計數。}

1.2.2 CD34^{+>/sup>細胞誘導分化 將CD34+>/sup>干細胞懸浮于10% FBS DMEM+ F12培養液中，調整細胞濃度為1×105>/sup>/ml。每個培養瓶加入5 ml培養基，并加入細胞因子rhGM-CSF 200 ng/ml、rhTNF-α 100 ng/ml，在37 ℃、5% CO₂ 飽濕條件下培養14 d，培養過程中隔日或3.5 d保留換液并加相應細胞因子。2周后收集細胞行臺盼藍染色檢測細胞活力并計數。}

1.2.3 形態觀察 培養過程中每天在倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況、形態變化并拍照。

1.2.4 流式細胞儀檢測樹突狀細胞CD83分子的表達 收集培養14 d的DC用冷Buffer（PH 7.2 PBS + 150 mM NaCl + 0.09% NaN3 + 0.2% BSA）懸浮為1×10^{6>/sup>/ml，每管加入100 μl細胞懸液。每管加入20 μl FITC-CD83，對照管加20 μl FITC-IgG，4 ℃避光過夜。適量Buffer洗滌細胞。棄上清，加Buffer 1 ml，混勻。流式細胞儀 （FACS Calibur SE，美國BD公司）按說明上機檢測。Winmdi 2.9軟件分析結果。}

1.3 統計學處理 應用SPSS 13.0統計軟件進行分析，所有數據均以x±s表示，

2 結果

2.1 細胞形態 50 ml臍帶血可分離出CD34^{+>/sup>細胞（1.1±0.2）×106>/sup>，臺盼藍染色（95±1）%呈陰性。在細胞因子GM-CSF及TNF-α聯合作用下，經14 d體外培養，CD34+>/sup>干細胞發育為成熟樹突狀細胞，擴增10～20倍。倒置顯微鏡下，CD34+>/sup>干細胞呈圓形，胞體小，在培養液中懸浮生長。在細胞因子作用下，CD34+>/sup>干細胞逐漸生長，第2天即可見部分細胞體積增大，但尚未見有集落生成。第3天開始，細胞開始形成集落，且細胞形態開始由圓形逐漸變成不規則形狀。隨著細胞的分裂增殖，細胞數量增多，集落逐漸變大，且在集落邊緣呈毛刺狀，周圍可見有樹突樣突起的細胞。集落在第8～9 d最大，以后逐漸減小，散在懸浮細胞增多。隨著細胞的逐漸成熟，大量的DC從集落中脫落，半懸浮生長于培養液中，其體積大小不一，形態多樣，有的短而粗，有的細長，可見分支，表面呈毛刺狀。典型的成熟DC呈星型或不規則狀，有較多的樹突狀突起。培養體系中尚可見極少數的單核細胞和巨噬細胞。}

2.2 成熟DC表面分子CD83表達 培養14 d的DC表面分子CD83用流式細胞儀檢測，表達率為（81.7±1.2）%。

3 討論

免疫磁珠技術是由20世紀70年代起步，80年代興起的一種新技術，近年來在細胞分離純化方面，特別是樹突狀細胞分離方面取得巨大的進展。本實驗采用免疫磁珠法分離CD34^{+>/sup>細胞，簡單方便，獲得足夠量的CD34+>/sup>細胞，且用CD34抗體標記的微磁珠并不影響CD34+>/sup>細胞的擴增和向DC方向分化，不影響DC的成熟與功能。}

有實驗^［4］顯示，不同的DC前體細胞增殖能力差異明顯，誘生獲得DC的時間和獲取DC的效率也不一樣。外周血單個核細胞來源的DC形成早，7～9 d即可分化成熟，但整個分化過程中細胞總量增生不明顯。Caux等^［5］發現，將臍血CD34^{+>/sup>細胞置于含有c-kit配體、GM-CSF和TNF-α的培養基中誘導5～7 d后，細胞分為CD14+>/sup>、c-fms+>/sup>、CD1a->/sup>和CD14->/sup>、c-fms->/sup>、CD1a+>/sup>兩類細胞亞群。繼續培養，前者可分化為巨噬細胞或者樹突狀細胞，后者先分化為具有郎格罕細胞特征的細胞；培養至12～14 d，再進一步分化為成熟的樹突狀細胞［6］。所以CD34+>/sup>細胞來源的DC形成晚，分化成熟需14 d，但分化過程中伴隨細胞數量增殖。相同數量的臍血，后者擴增DC的效率明顯高于前者。}

筆者采用免疫磁珠法從臍血分離CD34^{+>/sup>細胞，純度在95%以上，50 ml臍血分離出約1.1×106>/sup> 個CD34+>/sup>細胞，進行體外培養，在細胞因子作用下，發育為成熟的DC在80%以上，擴增量為10～20倍，足夠于進一步的研究應用。}

如果單獨應用GM-CSF誘導，CD34^{+>/sup>前體細胞只能分化為粒細胞和巨噬細胞，而將GM-CSF與TNF-α聯合應用，則可誘生出樹突狀細胞克隆。GM-CSF不但能誘導一系列特征性啟動因子的表達以啟動樹突狀細胞的分化［7］，而且能上調樹突狀細胞表達CD86，使成熟樹突狀細胞活化。而TNF-α對樹突狀細胞的成熟特別是在終末分化中有明顯的促進作用。同時，TNF-α與GM-CSF聯合應用可發揮兩者的協同作用。TNF-α作為第一信號，上調樹突狀細胞前體的GM-CSF受體，使其達到一定的閾值，以接受GM-CSF的刺激，引導前體細胞向樹突狀細胞分化［6］。本實驗聯合應用TNF-α與GM-CSF誘導CD34+>/sup>細胞，第3天開始出現集落，第9天集落最大，以后集落變小，培養液中大部分為半懸浮細胞。培養14 d后，細胞發育為成熟的樹突狀細胞。}

CD83被認為是樹突狀細胞充分成熟的標記，筆者對培養14 d的樹突狀細胞經流式細胞儀檢測CD83分子，陽性率為81.7%，說明細胞在2周培養后，大部分分化發育成熟。

本實驗結果表明，人臍血CD34^{+>/sup>干細胞在rhGM-CSF、rhTNF-α聯合誘導下，經14 d擴增培養，分化發育為大量高純度、形態功能成熟的DC，此方法簡便可靠，有很大的實用價值，為樹突狀細胞的應用研究打下了堅實的基礎。}

參 考 文 獻

［1］ Koopmann JO，Hammeiling GJ，Momburg F.Generation，intracellular tramsport and loading of peptides associated with MHC class Ⅰmolecules.Curr Opin Immunol，1997，9（1）:80-88.

［2］ HsuAK，KerrBM，JonesKL，et al.RNA loading of leukemic antigens into cord blood derived dendritic cells for immunotherapy.Biol Blood Marrow Transplant，2006，12（8）:855-867.

［3］ Guo G，Chen S，Zhang J，et al.Antitumor activity of a fusion of esophageal carcinoma cells with dendritic cells derived from cord blood.Vaccine，2005，23（45）:5225-5230.

［4］ 裴莉，陳潔平.人臍血不同前體細胞體外誘導分化為樹突狀細胞的研究.重慶醫學，2004，33（6）:835-837.

［5］ Caux C，Massacrier C，Vanbervliet B，et al.Activiation human dendritic cells through CD40 cross-linking.Exp Med，1994，180（4）:1263-1272.

［6］ 張錦堃，陳慎仁.樹突狀細胞與腫瘤免疫治療.汕頭大學出版社，2001：29-30.

［7］ Welte T，Koch F，Schuler G，et al.Granulocyte-macroophage colony stimulating factor induces a unique set of STAT factor in murine dendritic cells.Eur J Immunol，2003，27（10）:2723-2740.