雷帕霉素對乳腺癌多藥耐藥細胞的耐藥逆轉作用初探

[摘要] 目的 探討雷帕霉素對乳腺癌多藥耐藥細胞系MCF-7/ADR的耐藥逆轉作用。方法 MTT法測定10μM雷帕霉素、阿霉素（10、50、100、500、1000、5000、20000、40000、100000ng/mL）、雷帕霉素聯合阿霉素對MCF-7和MCF-7/ADR細胞的增殖率的影響。結果 對于MCF-7細胞的增殖率，10μM雷帕霉素對其無顯著影響；500ng/mL及以上濃度的阿霉素顯著降低增殖率；聯合10μM雷帕霉素后，能降低增殖率的濃度仍是500ng/mL及以上。對于MCF-7/ADR細胞，10μM雷帕霉素對其增殖率無顯著影響；40000ng/mL及以上濃度的阿霉素降低其增殖率；聯合10μM雷帕霉素后，1000ng/mL及以上濃度的阿霉素能降低其增殖率。結論 雷帕霉素對MCF-7/ADR細胞有耐藥逆轉作用。

[關鍵詞] 雷帕霉素；乳腺癌；多藥耐藥；逆轉

[中圖分類號] R737.9 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2011）24-11-02

The Initial Exploration about Reverse Effect of Rapamycin on Multidrug Resistance of Human Breast Cancer Cell

SHEN Xiangdi QIU Rong FAN Xingli CHEN Jian LIU Dandan

Zhejiang Medical College， Hangzhou 310053， China

[Abstract] Objective To explore the reverse effect of rapamycin on multidrug resistance of human breast cancer cell MCF-7/ADR. Methods MTT was applied for detecting the proliferation rates of MCF-7 cells and MCF-7/ADR cells which treated by rapamycin （10μM）， ADM （10，50，100，500，1000，5000，20000，40000，100000ng/mL），or rapamycin combined with ADM. Results For the proliferation rate of MCF-7 cells，rapamycin （10μM） did not affect it， ADM （500，1000，5000，20000，40000，100000 ng/mL） reduced it，and combined with rapamycin， the concentration of ADM which could reduce it was greater than or equal to 500 ng/mL. For the proliferation rates of MCF-7/ADR，rapamycin （10μM） did not affect it， ADM （40000，100000ng/mL） reduced it，and combined with rapamycin，the concentration of ADM which could reduce it was greater than or equal to 1000ng/mL. Conclusion Rapamycin could reverse the multidrug resistance of MCF-7 cells.

[Key words] Rapamycin； Breast cancer； Multidrug resistance； Reverse

雷帕霉素是絲氨酸-蘇氨酸激酶（mTOR）的特異性抑制劑，可以通過阻滯腫瘤細胞生長周期、誘導細胞凋亡、抑制腫瘤內血管生成過程等多種機制抑制腫瘤的生長，近來還有研究表明mTOR信號傳導通路還與腫瘤的多藥耐藥有關[1，2]。本研究旨在研究雷帕霉素對乳腺癌多藥耐藥細胞系MCF-7/ADR的耐藥逆轉作用。

1 材料與方法

1.1 細胞株

MCF-7細胞系（上海細胞庫）；MCF-7/ADR細胞系（南京凱基生物發展有限公司）。

1.2 儀器和設備

酶標儀（Thermo MK3，美國），冷凍離心機（Beckman Coulter-Allegra 64R，德國），細胞培養箱（Heraeus公司，德國），超凈工作臺（上海博迅醫療設備廠）。

1.3 試劑

雷帕霉素（臺州市晟欣醫藥化工有限公司），鹽酸阿霉素（ADR，上海君創生物科技有限公司），MTT（Sigma公司，美國），RPMI1640（杭州吉諾生物醫藥技術有限公司），小牛血清（杭州四季青生物公司），DMSO（國藥集團化學試劑有限公司），胰酶（杭州吉諾生物醫藥技術有限公司）。

1.4 實驗方法

1.4.1 細胞培養 MCF-7細胞在5%CO2、37℃條件下，在含10%小牛血清的RPMI1640培養液中常規培養，待細胞長滿瓶壁的2/3時，胰酶消化，傳代培養。MCF-7/ADR細胞的培養基為含有0.5μmol/L ADR的RPMI1640培養液，在實驗前兩周停止加入ADR，其余培養方法與MCF-7細胞相同。取對數生長期的MCF-7細胞、MCF-7/ADR細胞分別用胰酶消化，調整細胞的濃度至5×103/mL，每孔100μL，接種于96孔板中。放置于37℃、飽和濕度的5%CO2培養箱24h后備用。

1.4.2 雷帕霉素對MCF-7細胞增殖活性的影響 根據文獻用MTT法測定。采用1.4.1的方法準備MCF-7細胞，加藥。共分兩組，每組設4個復孔。①空白對照組；②雷帕霉素組：雷帕霉素的終濃度是10μM。24h后加入31.5μL的MTT（5mg/mL），培養4h后去除培養液，加入DMSO 200μL，震蕩5min后，570nm測定每孔的吸光值（OD）。細胞增殖率＝OD實驗組/OD對照組×100%。

1.4.3 雷帕霉素對MCF-7/ADR細胞增殖活性的影響 取1.4.1的方法準備的MCF-7/ADR細胞，采用1.4.2的方法計算出細胞增殖率。

1.4.4 阿霉素對MCF-7細胞和MCF-7/ADR細胞增殖活性的影響 細胞的增殖活性根據1.4.2的方法用MTT法測定，將準備好的MCF-7細胞和MCF-7/ADR細胞分別分組，每組設4個復孔。①空白對照組；②阿霉素組：加入25μL不同濃度的阿霉素，使其終濃度為10、50、100、500、1000、5000、20000、40000、100000ng/mL，藥物處理24h后，采用1.4.2的方法計算細胞增殖率。

1.4.5 雷帕霉素和阿霉素對MCF-7細胞增殖活性的影響 細胞的增殖活性根據1.4.2的方法用MTT法測定。取準備好的MCF-7細胞和MCF-7/ADR細胞，分別分組，每組設4個復孔。①空白對照組；②實驗組：加入25μL不同濃度的阿霉素，使其終濃度為10、50、100、500、1000、5000、20000、40000、100000ng/mL，再加入終濃度為10μM的雷帕霉素，藥物處理24h后，采用1.4.2的方法計算細胞增殖率。

1.5 統計學處理

數據經SPSS14.0軟件處理。所有數據均采用平均值±標準差（χ±s）表示，組間均數比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 雷帕霉素對細胞增殖活性的影響

與對照組相比，10μM的雷帕霉素處理過的MCF-7細胞（t=1.30，P＞0.05）與MCF-7/ADR細胞（t=-1.70，P＞0.05）的增殖率均無顯著差異。見表1。

2.2 不同濃度阿霉素對細胞增殖活性的影響

與對照組相比，MCF-7細胞經500ng/mL及以上濃度的阿霉素處理，細胞增殖活性有顯著差異（P＜0.05）；而MCF-7/ADR細胞在40000ng/mL和100000ng/mL濃度的阿霉素處理下，細胞增殖活性與對照組相比，有顯著差異（P＜0.05）。見表2。

2.3 雷帕霉素聯合阿霉素對細胞增殖活性的影響

MCF-7細胞中加入500ng/mL及以上濃度阿霉素聯合10μM雷帕霉素處理24h以后，細胞增殖率與對照組相比有顯著差異（P＜0.05）。而在MCF-7/ADR細胞中加入1000ng/mL及以上濃度阿霉素聯合10μM雷帕霉素處理24h以后，細胞增殖率與對照組相比有顯著差異（P＜0.05）。見表3。

3 討論

在本研究中，10μM的雷帕霉素作用于MCF-7細胞和MCF-7/ADR細胞24h，與對照組相比，細胞增殖率沒有顯著差異，說明這個濃度的雷帕霉素作用細胞24h不會影響細胞增殖的活性，對這兩種細胞都沒有細胞毒性。同時，我們也檢測了不同濃度的阿霉素對兩種細胞的增殖活性影響。結果發現，500ng/mL及以上濃度的阿霉素作用于MCF-7細胞24h，細胞的增殖活性與對照組相比有顯著差異，說明500ng/mL及以上濃度的阿霉素能降低MCF-7細胞的增殖。而對于MCF-7/ADR細胞，只有40000ng/mL和100000ng/mL的阿霉素處理24h后，細胞的增殖活性明顯降低，其他濃度和對照組相比均無顯著差異，這是MCF-7/ADR細胞具有耐藥性所決定的。本研究的目的是初步探討雷帕霉素對MCF-7/ADR細胞的多藥耐藥逆轉作用。因此，在做了以上基礎工作以后，我們將本身不產生細胞毒作用的10μM的雷帕霉素和不同濃度的阿霉素聯合分別作用于MCF-7細胞和MCF-7/ADR細胞。結果發現，500ng/mL及以上濃度的阿霉素可以降低MCF-7細胞的增殖率；而單獨阿霉素引起MCF-7細胞增殖率降低的濃度也是590ng/mL。而對于耐藥細胞系MCF-7/ADR，與雷帕霉素聯合后，1000ng/mL及以上濃度阿霉素可引起細胞增殖率的降低，抑制細胞的增殖；而單獨用阿霉素，需要40000ng/mL及以上濃度才能抑制細胞的增殖。前述實驗證明該濃度的雷帕霉素對細胞無直接毒性，說明加入雷帕霉素后，MCF-7/ADR細胞對阿霉素的敏感性增高。由本實驗結果可以推論雷帕霉素能逆轉MCF-7/ADR細胞的耐藥性。

在以往的研究中，膀胱癌多藥耐藥細胞系和B淋巴細胞多藥耐藥細胞系經雷帕霉素作用后，其多藥耐藥性均有所逆轉[2，3]。而本實驗也表明，在乳腺癌多藥耐藥細胞系MCF-7/ADR中，雷帕霉素也有此作用。多藥耐藥的逆轉涉及多種機制，雷帕霉素對于乳腺癌細胞的作用機制具體是什么，還需要進一步研究。

[參考文獻]

[1] Zoncu R，Efeyan A，Sabatini DM. mTOR： from growth signal integration to cancer， diabetes and ageing[J]. Nat Rev Mol Cell Biol，2011，12（1）：21-35.

[2] Grünwald V，DeGraffenried L，Russel D，et al. Inhibitors of mTOR reverse doxorubicin resistance conferred by PTEN status in prostate cancer cells[J]. Cancer Res，2002，62（21）：6141-6145.

[3] Pop IV，Pop LM，Ghetie MA，et al. Targeting mammalian target of rapamycin to both downregulate and disable the P-glycoprotein pump in multidrug-resistant B-cell lymphoma cell lines[J]. Leuk Lymphoma，2009，50（7）：1155-1162.

（收稿日期：2011-06-23）