胎盤生長(zhǎng)因子在乙肝肝硬化組織中的表達(dá)及意義探討

[摘要] 目的 研究胎盤生長(zhǎng)因子（PLGF）在乙肝肝硬化組織中的表達(dá)及其意義。方法 對(duì)乙肝肝硬化終末期行肝移植術(shù)的切除肝10例和肝移植供體肝組織8例用RT-PCR和免疫組化方法檢測(cè)PLGF mRNA及蛋白的表達(dá)。結(jié)果 PLGF mRNA和蛋白在肝硬化組織中有表達(dá)，均明顯高于正常肝組織中的表達(dá)水平，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論 PLGF在乙肝肝硬化組織中表達(dá)增加，不僅參與其中的炎癥過程，并且可能在肝硬化向肝癌發(fā)展的過程中起重要作用。

[關(guān)鍵詞] 乙型病毒性肝炎；肝硬化；胎盤生長(zhǎng)因子

[中圖分類號(hào)] R575.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 1673-9701（2011）24-76-02

Expression and Significance of Placenta Growth Factor in Tissue of Hepatic Cirrhosis after Viral Hepatitis Type B

LIN Shengdi1 CHEN Weilai2 PAN Chenwei3 LIN Wei3 TAO Chonglin4

1.Department of Intensive Care Unit， the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College， Wenzhou 325027， China； 2.Department of Neurology， the Third People's Hospital of Wenzhou， Wenzhou 325000， China； 3.Department of Infectious Disease， the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College， Wenzhou 325027， China； 4.Department of Hepatobiliary Surgery， the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College， Wenzhou 325000， China

[Abstract] Objective To investigate expression of placenta growth factor（PLGF）in the tissue of hepatic cirrhosis after viral hepatitis type B， and to explore the clinical significance of PLGF. Methods Expression of PLGF mRNA and protein in surgical specimens which including 10 samples of hepatic cirrhosis liver tissue and 8 samples of normal hepatic tissues were detected by RT-PCR and immunohistochemistry respectively. Results Levels of mRNA and protein of PLGF expressed in hepatic cirrhosis liver tissue were higher than those in normal hepatic tissue significantly （all P＜0.01）. Conclusion PLGF which got higher expression in the tissue of hepatic cirrhosis not only take part in the processes of hepatic cirrhosis， but also possibly play important roles in the processes of tumorigenesis in hepatic cirrhosis liver tissue.

[Key words] Viral hepatitis type B； Hepatic cirrhosis； Placenta growth factor

肝硬化是一種常見的慢性肝病，是由一種或多種病因長(zhǎng)期或反復(fù)作用，引起肝臟彌漫性損害。在我國(guó)，病毒性肝炎（尤其是乙型）是引起肝硬化的主要原因[1]。胎盤生長(zhǎng)因子（placenta growth factor，PLGF）屬血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子家族，它最早于1991年由Maglione等從人的胎盤cDNA文庫(kù)中分離純化而得，目前關(guān)于肝硬化組織中PLGF表達(dá)的研究國(guó)內(nèi)外鮮見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過研究PLGF在肝硬化組織中的表達(dá)，探討其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本

2005年1月～2008年12月收集于浙江省溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院手術(shù)切除的肝組織及肝移植手術(shù)供體肝。肝硬化肝組織（tissue of hepatic cirrhosis liver）10例，均為肝硬化終末期行肝移植術(shù)的切除肝，病理診斷為肝硬化肝組織。正常肝組織（normal hepatic tissue）8例（肝移植手術(shù)供體肝，病理證實(shí)為正常肝組織），作為對(duì)照組。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

即用型SABC免疫組化試劑盒，PLGF多克隆抗體（ABCAM公司）；DAB顯色劑（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；Trizol（Sigma公司）；焦碳酸二乙酯（DEPC）（Sigma公司）；總RNA提取試劑盒（美國(guó)Life Technologies公司）；RT-PCR試劑盒（大連寶生物公司）。

1.3 PCR引物

引物序列通過Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)，經(jīng)過PubMed Blast確認(rèn)，由生工生物工程（上海）有限公司合成。引物序列：β-actin：正鏈5’-TCG ACA ACG GCT CCG GCA T-3’，負(fù)鏈5’-AAG GTG TGG TGC CAG ATT TTC-3’，產(chǎn)物241bp；PLGF：正鏈5’-CTG CTG TCT GCG GAG GAA-3’，負(fù)鏈5’-ACA AGG GAA CGA AGG ACG-3’，產(chǎn)物380bp。

1.4 免疫組化方法檢測(cè)標(biāo)本PLGF蛋白表達(dá)

以4%多聚甲醛固定標(biāo)本組織塊24h，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)石蠟切片，厚約4μm。石蠟切片脫蠟水化。3% H2O2室溫孵育20min，雙蒸水沖洗，PBS浸泡后，抗原修復(fù)采用枸櫞酸緩沖液中微波修復(fù)15min，PBS沖洗，山羊血清封閉，室溫孵育后傾去血清，滴加一抗工作液，37℃孵育2h，PBS沖洗后滴加二抗工作液，37℃孵育30min，PBS沖洗，滴加辣根酶標(biāo)記SP工作液，37℃孵育30min，經(jīng)PBS沖洗，DAB顯色劑顯色以及蘇木素復(fù)染。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。PLGF免疫組化結(jié)果使用美國(guó)Image-Pro Plus 5.0專業(yè)圖像分析軟件測(cè)定平均光密度值，重復(fù)3次，取平均吸光度值作為蛋白的相對(duì)含量[2]。

1.5 RT-PCR方法檢測(cè)PLGF mRNA水平表達(dá)

Trizol法抽提總RNA，常規(guī)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在PCR儀內(nèi)，94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，57℃退火30s，72℃延伸60s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 5min。4℃保存。2h內(nèi)PCR產(chǎn)物電泳，電壓120V 30min。電泳結(jié)束后取出凝膠，Image Master VDS成像系統(tǒng)攝影存盤后應(yīng)用計(jì)算機(jī)圖像分析軟件（Total lab V101）行灰度掃描分析。以目的基因與β-actin的PCR產(chǎn)物條帶灰度比值作為反映目的基因mRNA水平的相對(duì)指標(biāo)，RT-PCR反應(yīng)體系中未加入逆轉(zhuǎn)錄酶的作為空白對(duì)照[2]。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，組間比較使用t檢驗(yàn)，均在SPSS11.5軟件上完成。

2 結(jié)果

2.1 PLGF免疫組化結(jié)果

肝硬化組的PLGF蛋白表達(dá)高于正常肝組（封三圖1、圖2），差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=14.062，P＜0.01）。見表1。

2.2 PLGF RT-PCR結(jié)果

肝硬化組的PLGF mRNA產(chǎn)物條帶平均光密度比值明顯高于正常肝組（封三圖3），差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.952，P＜0.01）。見表1。

3 討論

臨床上，對(duì)于慢乙肝患者的轉(zhuǎn)歸有肝炎-肝硬化-肝癌三部曲一說。其中，對(duì)于乙肝肝硬化的研究尤為值得重視，但既往研究中少有設(shè)正常肝組織對(duì)照。本研究中采用肝移植供體肝（病理診斷均為確切的正常肝，臨床上也排除了肝炎和慢性肝病）作為乙肝后肝硬化（病理診斷為肝硬化，未發(fā)現(xiàn)肝癌）的對(duì)照組，完善了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。

肝硬化的主要發(fā)病機(jī)制是肝臟組織在各種因素?fù)p傷下的持續(xù)性長(zhǎng)期的炎癥導(dǎo)致的進(jìn)行性纖維化，最終使肝小葉結(jié)構(gòu)和血液循環(huán)改建而形成肝硬化[3]。多個(gè)研究表明胎盤生長(zhǎng)因子與許多炎癥有關(guān)，在炎癥過程中由炎癥細(xì)胞產(chǎn)生并作為其趨化因子，參與如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、過敏反應(yīng)多種炎性病理過程[4，5]。乙肝肝硬化的形成過程也可以說是一個(gè)炎癥性的病理過程，PLGF的產(chǎn)生可能與肝內(nèi)受刺激的血管內(nèi)皮細(xì)胞或者炎癥細(xì)胞有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中，肝硬化組織中PLGF mRNA及蛋白有較高水平的表達(dá)，而正常肝幾乎無表達(dá)，證實(shí)PLGF高表達(dá)與肝硬化組織中不斷發(fā)生的炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，這種現(xiàn)象也說明不僅肝硬化形成過程是炎癥過程，而且肝硬化形成后的組織中同樣具有類似上述疾病炎癥病理過程的特點(diǎn)。因此，肝硬化形成后，病情并未就此穩(wěn)定，而是仍在進(jìn)展。而且PLGF的表達(dá)水平與炎癥程度具有一定的聯(lián)系，其相關(guān)性有待進(jìn)一步探討。

此外，既往的研究中報(bào)道缺氧可以誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子家族成員的高表達(dá)，缺氧上調(diào)VEGF基因表達(dá)主要與缺氧誘導(dǎo)的特異性DNA結(jié)合蛋白缺氧誘導(dǎo)因子密切相關(guān)[6，7]。PLGF作為該家族中的重要成員，應(yīng)該具有此種特點(diǎn)，缺氧可能是引起肝硬化組織PLGF高表達(dá)的另一原因。乙肝肝硬化組織由于纖維組織的影響，肝組織細(xì)胞因血供不足而存在缺氧的狀態(tài)；PLGF在肝組織缺氧的環(huán)境中表達(dá)增強(qiáng)，與文獻(xiàn)報(bào)道符合。另外，PLGF的產(chǎn)生增多可以說是肝臟機(jī)體缺氧負(fù)反饋調(diào)節(jié)過程的一種反應(yīng)，因?yàn)镻LGF產(chǎn)生于缺氧環(huán)境，又可通過其生物學(xué)功能發(fā)揮著調(diào)節(jié)血管功能的作用，從而改善肝臟組織的血供。

因此，PLGF在乙肝后肝硬化的形成過程中表達(dá)增加，在肝臟炎癥性病理過程中扮演一定的角色，其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。此外，PLGF是參與多種腫瘤血管生成的重要的促血管生成因子，多種腫瘤的形成（包括肝癌）與PLGF有關(guān)[2，8，9]；并且，多個(gè)研究小組報(bào)道了PLGF在各種實(shí)體瘤中的表達(dá)上調(diào)，過度的PLGF表達(dá)導(dǎo)致腫瘤生長(zhǎng)速度加快[10]；而約10%～15%的肝硬化患者可發(fā)生原發(fā)性肝癌。因此肝硬化組織中PLGF的高表達(dá)可能參與了肝硬化向肝癌發(fā)展的過程，甚至可能發(fā)揮了十分重要的作用，有待更多的實(shí)驗(yàn)去證實(shí)。

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（收稿日期：2011-05-26）