新城疫病毒作用下卵巢癌裸鼠移植瘤Survivin、Caspase-3的表達(dá)

[摘要] 目的 研究新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）對卵巢癌裸鼠移植瘤Survivin、Caspase-3表達(dá)的影響。方法 ①細(xì)胞培養(yǎng)：人卵巢癌細(xì)胞SKOV-3細(xì)胞的培養(yǎng)；②建立裸鼠移植瘤模型；③實(shí)驗(yàn)分組：分為實(shí)驗(yàn)組與對照組，實(shí)驗(yàn)組為腫瘤內(nèi)注射NDV病毒抗卵巢癌； ④應(yīng)用免疫組化SP法觀察Survivin、Caspase-3的表達(dá)。結(jié)果 Survivin表達(dá)實(shí)驗(yàn)組與對照組均為陽性，實(shí)驗(yàn)組明顯弱于對照組，差異有顯著性（P＜0.05） ；Caspase-3表達(dá)實(shí)驗(yàn)組均為陽性，對照組1例表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組明顯強(qiáng)于對照組，差異有顯著性（P＜0.05）。結(jié)論NDV可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制其生長；其機(jī)制可能通過激活Caspase-3凋亡，抑制Survivin抗調(diào)亡作用。

[關(guān)鍵詞]卵巢癌；NDV；裸鼠移植瘤；免疫組化

[中圖分類號] R737.31 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號]1673-9701（2011） 24-06-02

The Expression of Survivin and Caspase-3 in the Ovarian Cancer Nude Mice Transplanted Tumor by Newcastle Disease Virus

SU Lirong

Department of Obstetrics and Gynecology，Beijing Municipal Shunyi District Health Care Hospital for Women and Children， Beijing 101300， China

[Abstract] Objective To investigate the expression of Survivin and Caspase-3 in the ovarian cancer nude mice injected by Newcastle disease virus. Methods SKOV-3 tumor cells were cultured；the model of SKOV-3 transplanted tumor model in the nude mice were established. We injected the NDV into the transplanted tumor in experiment group，water was injected in control group；Immunohistochemistry SP was used to detect the expression of Survivin and Caspase-3. Results The expression of Survivin was positive in both A and B group and the stain result in group A was lighter than in group B（P＜0.05）. The expressions of Caspase-3 were all positive in experiment group，only had one in control group and experiment group was inferior than control group（P＜0.05）.Conclusion When NDV is injected into，apoptosis is induced and the growth of neoplastic cell is inhibited. The mechanisms may be through activation of Caspase-3 and inhibition of anti-apoptosis effect of Survivin.

[Key words] Ovarian cancer；NDV；Transplanted tumor in nude mice；Immunohistochemistry

卵巢惡性腫瘤嚴(yán)重威脅婦科腫瘤患者生命，生物治療作為腫瘤治療的模式日益受到重視。新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）是近年引起重視的一種病毒，有一定抑瘤作用。腫瘤的發(fā)生發(fā)展與細(xì)胞凋亡異常關(guān)系密切，凋亡的調(diào)控中凋亡抑制蛋白起重要作用。凋亡抑制蛋白Survivin通過抑制凋亡蛋白Caspase-3的活化或抑制己活化的蛋白酶活性發(fā)揮作用。Caspase-3是細(xì)胞凋亡調(diào)控中的關(guān)鍵蛋白酶，Survivin的抑制凋亡功能最強(qiáng)。

本實(shí)驗(yàn)研究NDV對卵巢癌裸鼠移植瘤細(xì)胞Survivin、Caspase-3表達(dá)的影響，進(jìn)一步證實(shí)NDV可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制其生長，其機(jī)制可能通過激活Caspase-3凋亡，抑制Survivin抗調(diào)亡作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 腫瘤細(xì)胞 卵巢癌細(xì)胞由哈爾濱市腫瘤醫(yī)院細(xì)胞生物所提供。

1.1.2 動物 6周齡裸鼠22只，雌雄各半，16~18g，由北京動物中心提供。

1.2 試劑

新城疫病毒（NDV-D90）；胎牛血清；PBS磷酸鹽緩沖液；RPMI-1640培養(yǎng)液 （GIBCO公司）；青霉素、鏈霉素；胰酶；其他試劑由實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞株呈貼壁生長，用含10%小牛血清、100 U/mL青霉素、100U/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液及在CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的37℃恒溫箱中、于飽和濕度下進(jìn)行培養(yǎng)。用胰酶使貼壁細(xì)胞成為細(xì)胞懸液，離心得到細(xì)胞沉淀，再加培養(yǎng)液10mL成重懸細(xì)胞，取0.5mL懸液進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)，反復(fù)計(jì)數(shù)3次，實(shí)驗(yàn)中計(jì)數(shù)細(xì)胞總量，生理鹽水洗滌2次，將細(xì)胞調(diào)為5×107/mL。

1.3.2 病毒培養(yǎng)與純化 病毒保存液接種于雞胚，37℃培養(yǎng)72h，擴(kuò)增病毒。培養(yǎng)結(jié)束后，將接種的雞胚放入4℃冰箱冷凍過夜。PBS調(diào)整NDV病毒密度為1×107pfu/mL，病毒分裝凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 裸鼠卵巢癌模型的構(gòu)建 裸鼠飼養(yǎng)在恒溫（25℃～27℃）、恒濕（45%～50%）、無特殊病原菌（specific pathogen free，SPF）的條件，實(shí)驗(yàn)過程無菌，用一次性無菌注射器抽取SKOV-3細(xì)胞懸液約0.2mL注入實(shí)驗(yàn)裸鼠左側(cè)腋部皮下，每只鼠設(shè)1個皮下接種點(diǎn)，每點(diǎn)接種0.2mL細(xì)胞懸液，約含1×107個腫瘤細(xì)胞。注射后7d左右，在小鼠左側(cè)腋下長出大小一致腫瘤，即造模成功。

1.3.4 分組及病理觀察 皮下接種腫瘤細(xì)胞7d建模成功后把裸鼠隨機(jī)分成兩組，每組均為8只（NDV組、對照組）。NDV組：瘤內(nèi)注射NDV 0.3mL/只（病毒數(shù)約1×106pfu）；對照組：瘤內(nèi)注射PBS 0.3mL/只；切取小塊瘤組織標(biāo)本，常規(guī)HE染色；免疫組化SP法。

1.4 結(jié)果判定

陽性細(xì)胞呈棕黃色著色，細(xì)胞著色強(qiáng)度分級：以多數(shù)陽性細(xì)胞呈現(xiàn)的顏色進(jìn)行分類： 顯色強(qiáng)度與背景無明顯差別為陰性；顯色程度為淡黃色或個別細(xì)胞呈黃至棕黃色為弱陽性（+），記1分；棕黃色中度陽性（++），記2分； 細(xì)胞呈棕黃色染色為強(qiáng)陽性（+++），記3分。陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)記分和細(xì)胞著色強(qiáng)度記分相加即為最終積分。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS14.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。NDV對卵巢癌裸鼠移植瘤Survivin、Caspase-3表達(dá)的影響采用秩和檢驗(yàn)分析，P ＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 HE染色

實(shí)驗(yàn)組：癌細(xì)胞旁有凋亡細(xì)胞，體積縮小，核固縮。對照組： 細(xì)胞核大，不規(guī)則，染色質(zhì)濃縮，形態(tài)多樣，有20%的壞死區(qū)。

2.2 免疫組織化學(xué)

2.2.1 皮下移植瘤Caspase-3表達(dá) Caspase-3陽性染色主要位于細(xì)胞漿，呈棕黃色。NDV組均陽性表達(dá)，對照組Caspase-3只有1例表達(dá)，且NDV組棕黃染色明顯強(qiáng)于對照組，兩組差異有顯著性（P＜0.05）。見圖1、表1。

2.1.2 皮下移植瘤Survivin表達(dá) Survivin陽性染色主要定位于細(xì)胞漿，也可見細(xì)胞核著色呈棕黃色，NDV組與對照組Survivin均為陽性表達(dá)，NDV組棕黃染色明顯弱于對照組，差異有顯著性（P＜0.05）。見圖2、3及表2。

3 討論

新城疫病毒 （NDV） 為不分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA 病毒[1]，關(guān)于NDV 治療腫瘤的機(jī)制，Siba等[2]研究發(fā)現(xiàn)，新城疫病毒介導(dǎo)溶瘤的機(jī)制既包括內(nèi)源通路也包括外源通路。2007年García-Sastre等[3]首次報道了應(yīng)用重組NDV 病毒進(jìn)行癌癥治療的研究。本實(shí)驗(yàn)確定新城疫病毒抗腫瘤作用，NDV對荷瘤裸鼠卵巢癌細(xì)胞Survivin、Caspase-3表達(dá)的影響，研究其對卵巢癌細(xì)胞的生長抑制作用。結(jié)果表明NDV 對卵巢癌細(xì)胞有抑制作用，NDV具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，與國外文獻(xiàn)報道相符合[4]。

Caspase-3是Caspase家族核心蛋白酶，是凋亡關(guān)鍵酶。大多數(shù)細(xì)胞凋亡依賴于Caspase-3。當(dāng)Caspase的活性受抑制引起細(xì)胞凋亡與增殖動態(tài)平衡失調(diào)，就引起多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。NDV誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是Caspase-3依賴的凋亡途徑殺傷腫瘤細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)HE染色光鏡下見大量壞死區(qū)，癌細(xì)胞周邊見凋亡細(xì)胞，細(xì)胞縮小、變圓，細(xì)胞核染色質(zhì)致密、固縮，聚集于核膜下，說明NDV 可有效抑制腫瘤細(xì)胞生長。免疫組化Caspase-3在鼠移植瘤內(nèi)幾乎呈陰性表達(dá)，NDV注射后Caspase-3明顯呈陽性表達(dá)，提示NDV誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡與Caspase-3的激活明顯相關(guān)。NDV能夠明顯促進(jìn)細(xì)胞凋亡抑制瘤細(xì)胞生長，有明顯抑瘤作用。細(xì)胞凋亡（apoptosis） 是控制細(xì)胞生存與死亡的關(guān)鍵機(jī)制。Survivin 是凋亡抑制蛋白（IAP） 家族成員之一。Survivin陽性染色主要定位于細(xì)胞漿，也可見細(xì)胞核著色，呈棕黃色。研究表明Survivin可通過多種調(diào)控機(jī)制發(fā)揮其強(qiáng)大的抗凋亡作用、促進(jìn)細(xì)胞增殖；Survivin抗凋亡機(jī)制之一是通過抑制Caspase-3活性發(fā)揮抗凋亡作用。Survivin與Caspase-3結(jié)合抑制Caspases 的活性， 阻斷細(xì)胞的凋亡過程，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增生。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)卵巢癌皮下移植瘤Survivin表達(dá)為強(qiáng)陽性，而注射NDV組棕黃染色明顯弱于注射生理鹽水組，表明Survivin可能阻斷細(xì)胞凋亡過程，促進(jìn)了卵巢癌細(xì)胞不斷增殖；Survivin可能直接作用于Caspase-3并抑制其活性，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡減少而抑制凋亡作用增強(qiáng)，腫瘤細(xì)胞過度增生。注射NDV后Caspase-3表達(dá)增加而Survivin表達(dá)減弱，提示NDV誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡可能激活Caspase-3的凋亡活性而抑制Survivin的抗凋亡過程。本實(shí)驗(yàn)NDV瘤內(nèi)注射誘導(dǎo)凋亡抑制瘤細(xì)胞生長，調(diào)動機(jī)體抗腫瘤的免疫功能，NDV為治療卵巢癌提供新思路。

NDV通過激活Caspase-3凋亡作用，抑制Survivin抗調(diào)亡，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制其生長。新城疫病毒（NDV）有可能成為卵巢癌生物治療的有效藥物，Survivin、Caspase-3可能成為療效指標(biāo)之一。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Mayo MA. A summary of taxonomic changes recently approved by ICTV[J]. Arch Virol， 2002， 147（8）： 1655-1663.

[2] Subbiah E， Daniel R， Siba KS， et al. Newcastle Disease Virus exerts oncolysis by both intrinsic and extrinsic caspase-dependent pathways of cell death[J]. J Virol， 2006，80（15）： 7522–7534.

[3] Vigil A， Park MS， García-Sastre A， et al. Use of reverse genetics to enhance the oncolytic properties of Newcastle disease virus[J]. Cancer Res， 2007， 67（17）： 8285–8292.

[4]盧圣棟. 現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M]. 第 2 版.北京：高等教育出版社， 2001： 111-114.

（收稿日期：2010-08-18）