人脂肪干細胞的分離培養及鑒定

摘 要 目的：探索從健康成人脂肪組織中分離、培養并鑒定脂肪干細胞。方法：用健康成人的脂肪組織，剔除可見纖維結締組織后剪碎，膠原酶法分離并體外培養脂肪干細胞，并進行流式細胞術鑒定。結果：可以從健康成人脂肪組織中提取出脂肪干細胞，體外環境擴增傳代，流式細胞儀檢測細胞表面高度表達CD29，CD44，CD105等，具有間充質干細胞特性。結論：可以從人脂肪組織中分離、培養出脂肪干細胞。

關鍵詞 脂肪干細胞 分離 培養 鑒定 體外實驗

doi:10.3969/j.issn.1007-614x.2011.08.004

組織工程的一個研究重點，是種子細胞的來源。研究發現脂肪組織含有一種被稱為ADSCs的細胞，它具有一般干細胞的特性，與骨髓干細胞相比，它具有明顯優勢，在來源、取材、擴增能力方面，都是骨髓干細胞所無法比擬的，可作為種子細胞應用于組織工程。

材料與方法

試劑與儀器：低糖DMEM培養液，Ⅰ型膠原酶，胎牛血清，PBS緩沖液，0.25%胰蛋白酶，恒濕培養箱，倒置顯微鏡，細胞計數儀，流式細胞儀，低速水平離心機，超凈工作臺，CD29、CD44、CD105。

脂肪組織來源：實驗所用成人脂肪組織來自蚌埠醫學院第一附屬醫院抽脂術的健康女性，年齡25～45歲。

脂肪干細胞的原代培養：無菌條件下提取脂肪組織約15g，PBS液洗去紅細胞。眼科剪剔除脂肪組織中可見血管，剪碎至細小顆粒，0.1%Ⅰ型膠原蛋白酶消化，1500r/分離心10分鐘，去除脂肪細胞及上清液，D-hanks液重懸沉淀，200目細胞篩過濾，1500r/分離心10分鐘，所得細胞提取物用含15%胎牛血清的高糖DMEM培養液重懸，以適當密度接種于無菌培養瓶中，在37℃、CO₂體積分數為5%、飽和濕度的培養箱中孵育，5天后首次換液，之后3天換液1次，待原代細胞達85%融合時消化傳代。

脂肪干細胞的傳代培養：原代培養細胞達到85%融合時，以0.25%胰蛋白酶將貼壁細胞消化分離3～5分鐘，1∶2進行傳代，接種于25ml培養瓶中，3天換液1次，當貼壁細胞接近融合時再次傳代。光學顯微鏡下觀察細胞生長及形態。

流式細胞儀檢測相關抗原：流式細胞儀對第3代脂肪干細胞表面相對特異性抗原進行檢測。0.25%胰蛋白酶消化待檢細胞，1500r/分離心10分鐘，在細胞沉淀中（細胞數量約1×10⁶）分別加入FITC-CD44熒光抗體，PE-CD29熒光抗體，APC-CD105熒光抗體各20μl，4℃孵育30分鐘，再用PBS緩沖液清洗2遍，最后用10%福爾馬林固定細胞，上機測定抗原的陽性率。

結 果

脂肪干細胞的形態：將有脂肪干細胞貼壁的培養瓶口旋緊，水平放置在倒置顯微鏡下觀察，在原代細胞培養24小時后可見少量較大的呈梭形的脂肪干細胞貼壁，4天首次換液，細胞清晰可見，呈多角形、紡錘形，集落樣生長。9天后細胞生長明顯增加，呈渦旋狀生長。從原代培養到第14天時可見細胞鋪滿瓶底80%左右。而傳代細胞生長速度明顯快于原代細胞。傳代后細胞增殖明顯加快，于第3天開始數量明顯增多，5～6天后細胞即已長滿培養瓶底，細胞排列更加整齊有序，雜質細胞極少見。見圖1、2。

脂肪干細胞的表型特征：流式細胞儀分析第3代的脂肪干細胞的細胞表型，CD29陽性率為86%±2%，CD44陽性率為93%±1%，CD105陽性率為78%±2%。見圖3。

討 論

脂肪干細胞的鑒定，尚無直接的方法。一般通過培養過程中出現的分化表型逆推得知。研究證實多種干細胞皆可表達CD44，用免疫組織化學方法檢測細胞CD44陽性表達，表明細胞源自干細胞^［1］。免疫熒光和流式細胞術檢測顯示，CD29、CD44、CD105、CD13是間充質干細胞的特征性表面標志。它們在脂肪干細胞中陽性表達說明脂肪干細胞具有間充質干細胞表型^［2］。

圖3 脂肪干細胞的表型特征

陶凱等^［3］通過不同血清濃度作用下生長曲線繪制發現，在血清濃度為15%和20%時，在最短時間內細胞可進入平臺期，達到細胞增殖高峰期，綜合考慮性價因素，實際應用中可將15%作為血清的最適宜濃度。通過兩代生長曲線發現，第2代細胞較原代細胞更快進入增殖高峰，即細胞在最初傳代后，生長加快，與實際培養中所見的適度傳代促進增殖相一致。筆者在實驗過程中也得到了相似的結論。需要強調的是，研究中采用的雖是公認的分離培養流程，但實際操作中得到的仍是一種混合細胞，其中混雜有部分前體細胞，如何純化及怎樣示蹤和標記脂肪干細胞，是該領域亟需解決的問題。

參考文獻

1 付柏林，郭力.脂肪干細胞在表皮組織工程中的研究進展［J］.瀘州醫學院學報，2009，32（1）:80-82.

2 王紅祥，李賓公，邵詩穎，等.人脂肪組織分離培養基質干細胞的方法及其表型鑒定［J］.中國臨床康復，2006，10（41）:16-18.

3 陶凱，劉曉燕，梁久龍，等.人脂肪組織來源干細胞體外培養條件的優化［J］.中國美容整形外科雜志，2007，18（3）:223-226.