一種通用的質(zhì)粒構(gòu)建方法的探索

摘 要:PCR產(chǎn)物與克隆載體連接是基因克隆環(huán)節(jié)中重要的一步。文章介紹了一種簡便、通用的質(zhì)粒構(gòu)建方法。此法是在PCR引物設(shè)計(jì)時(shí)，在目的片段5′端加上BsaI序列，然后通過BsaI酶切產(chǎn)生具有相同粘性末端的載體和插入片段，經(jīng)過連接，獲得重組質(zhì)粒。

關(guān)鍵詞:質(zhì)粒構(gòu)建 反向PCR BsaI 無縫連接

中圖分類號(hào):Q782文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):1674-098X(2011)04(b)-0085-02

A Universal throughput Method of Constructing Plasmids

(Institute of Biological Sciences and Biotechnology，Donghua University，Shanghai 201620，China)

Abstract:The article describes a simple and throughput method to construct plasmid.The method is to add the sequence of BsaI to 5' primer end，producing vectors and inserts with the same cohesive terminus by BsaI digestion，and at last to get recombinant plasmids by ligation.

Key words:plasmid construction;reverse PCR;BsaI;Seamless ligation

質(zhì)粒構(gòu)建技術(shù)是基因工程常用的技術(shù)之一，即將一段需要克隆的外源DNA片段插入到載體DNA分子中形成重組DNA分子，然后將該重組載體轉(zhuǎn)運(yùn)到宿主細(xì)胞中[1，2]，常規(guī)質(zhì)粒的構(gòu)建方法是在插入片段和載體兩端分別尋找相同的酶切位點(diǎn)，即雙酶切后可以產(chǎn)生相同的粘性末端[3，4]。本方法克服了這個(gè)局限性，通過利用BsaI酶切特點(diǎn)實(shí)現(xiàn)了載體與插入片段的無縫連接。本實(shí)驗(yàn)以載體pKH和DNA片段CP(一種蛋白質(zhì)內(nèi)含子的編碼基因)為例介紹這種通用并且簡便的質(zhì)粒構(gòu)建方法。

1 材料與方法

1.1 材料

以質(zhì)粒pKH作為構(gòu)建質(zhì)粒的載體，pMCP含有編碼CP的基因。質(zhì)粒pKH(3516bp)和pMCP來自加拿大DalhousieUniversityPaulLiu教授實(shí)驗(yàn)室，含有氨芐青霉素抗性基因和卡那霉素抗性基因，常被用來作為分子生物學(xué)試驗(yàn)的載體。本實(shí)驗(yàn)中所選擇的pKH的插入位點(diǎn)位于卡那霉素抗性基因中(圖1)。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

圖2(A)展示了BsaI酶切位點(diǎn)，它的識(shí)別序列與切割序列不一致，它在識(shí)別序列后的第一位堿基和互補(bǔ)鏈的第五位堿基切割。在載體的插入位點(diǎn)處設(shè)計(jì)一對(duì)含有BsaI酶切位點(diǎn)的引物，對(duì)載體進(jìn)行反向PCR，引物5'端加上BsaI酶切序列和保護(hù)堿基，另外還需要補(bǔ)充目的片段末端的四個(gè)堿基?！?br>