產腈水合酶優良菌種的選育及其在生產中的應用研究

摘 要:本文通過出發菌株Nocardia.sp.163搖瓶發酵96h后分別向發酵液中間歇加入丙烯腈和催化生成高濃度丙烯酰胺分別對菌絲的毒害和耐受作用以及發酵液中殘存菌絲涂布平板置于18℃低溫培養成單菌落，篩選到一株比出發菌株Nocardia.sp.163相對腈水合酶酶活提高了76%的24號優良菌株。該菌株在催化腈水合生成丙烯酰胺的反應中，產酰胺酶酶活性比出發菌株降低了近50%;丙烯酰胺水溶液的電導率比出發菌株降低了45%，反應次數提高了3.33次，丙烯酰胺放料濃度提高了5.93%。

關鍵詞:諾卡氏菌 腈水合酶 丙烯酰胺耐受 菌種選育

中圖分類號:TQ925文獻標識碼:A文章編號:1674-098X(2011)04(b)-0006-03

腈水合酶(nitrile hydratase，NHase)是生物催化法生產丙烯酰胺(acrylamide，AM)的催化劑，能催化丙烯腈(acrylonitrile，AN)水合生成丙烯酰胺。該酶的活性大小是微生物法生產丙烯酰胺的關鍵技術。丙烯酰胺(AM)是精細化工的重要產品之一，是合成水溶性線型高分子聚合物——聚丙烯酰胺(PAM)系列產品的唯一單體，PAM廣泛用于石油、地質、冶金、造紙、紡織、水處理等經濟建設的各個領域，號稱“百業助劑”。 在工業生產中，當丙烯酰胺達到一定濃度后，腈水合酶的催化速率顯著降低，丙烯酰胺濃度很難有進一步提高，終濃度通常為300～400 g/L[3，4]。要得到丙烯酰胺晶體，還要通過蒸氣濃縮及結晶才能得到98%的含量，生產中得到的結果表明，提高丙烯酰胺溶液百分比濃度可減少蒸氣用量。所以提高腈水合酶菌的丙烯酰胺耐受性有重要的意義。同時，丙烯酰胺水溶液中電導率的高低直接影響丙烯酰胺生產的效益。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 產腈水合酶的菌

Nocardia.sp.163，為本實驗室保藏。

1.1.2 培養基

1.1.2.1 斜面和平板培養基(g/L)

葡萄糖10.0;K2HPO40.5;KH2PO40.50;NaC1 1.0;MgSO4.7H2O，0.5;酵母浸膏3.0;瓊脂，20.0。

1.1.2.2 發酵培養基(g/L)

葡萄糖20.0;K2HPO4 0.50;KH2PO40.50;MgSO4.7H2O0.50;谷氨酸1.0;脲7.0;酵母浸膏5.0;CoCl2.6H2O，10mg/L;調pH值7.50。以上培養基成分除酵母浸膏和瓊脂是生化試劑外，其余皆為分析純。

1.2 方法

1.2.1 菌體發酵培養

將Nocardia.sp.163斜面菌種菌塊接于盛有30mL發酵培養基的150mL搖瓶中進行發酵培養，搖床轉速240r/min，溫度為28℃。培養96h后得到具有腈水合酶活性的發酵液。

1.2.2 提高腈水合酶產生菌對底物丙烯酰胺濃度耐受性的方法

將接種Nocardia.sp.163斜面菌種的搖瓶培養96 h后，分別在培養96h、98h、100h、102h、104h、106h、108h、110h、112h和114h分別向搖瓶發酵液中加入含量99%定量丙烯腈2mL繼續搖瓶培養，菌體產生腈水合酶催化丙烯腈生成丙烯酰胺作用2h后，分別在培養98h、100h、102h、104h、106h、108h、110h、112h、114h和116h分別從搖瓶中取出2mL發酵液，其中1mL為分別檢測發酵液中丙烯酰胺濃度和腈水合酶活性，另1mL發酵液稀釋后涂布在固體平板上，置于28℃恒溫培養96h分別進行平板菌落計數和殘存百分率。同時搖瓶96h在未加丙烯腈前取發酵液2mL，分別進行平板菌落計數和丙烯酰胺濃度及腈水合酶活性檢測，以作對照處理。

1.2.3 低溫馴化的方法

1)從上述已連續6次分別加2mL丙烯腈搖瓶培養110h搖瓶中取出發酵液1mL，稀釋10倍液分別涂布在15皿平皿固體培養上，然后將已涂布15皿平皿分別置于12℃、14℃、16℃、18℃、20℃培養箱中進行低溫培養處理，每種溫度3皿，培養96h。

2)再將5種低溫培養平板上長出稀少菌落分別接種斜面培養基上，置于28℃恒溫培養箱恒溫培養96h至菌苔生長豐滿。

3)將不同低溫處理單菌落斜面菌塊接于盛有30mL發酵培養基的150mL搖瓶中進行發酵培養，搖床轉速240r/min，溫度為28℃.培養96h后分別檢測不同低溫處理搖瓶發酵液中腈水合酶活性液。

1.2.4 丙烯酰胺水溶液的制備

準確稱取40g晶體丙烯酰胺，置100mL 容量瓶中，加蒸餾水至刻度，配制成40%丙烯酰胺水溶液，置冰箱保存。

1.2.5 檢測方法

1.2.5.1 腈水合酶活性的測定

腈水合酶活性測定:準確移取1mL發酵液，19mL磷酸緩沖液于150mL具塞三角瓶中，把三角瓶放入恒溫水浴，開啟振蕩，溫度恒定在28℃，加入1000μLAN，用秒表控制，準時反應5min，用4moL／LHCL200μL中止反應，用氣相色譜儀測定反應液中生成的丙烯酰胺含量。

1.2.5.2 酰胺酶的測定

取8個150mL具塞三角瓶，編號后，依次移入4mL磷酸緩沖液，再依次向三角瓶中各移入等量的發酵液10mL，放入28℃恒溫水浴振蕩器中。加入40%丙烯酰胺水溶液1mL進行反應，30min后，用6N HCL終止反應，按氣相色譜法測定丙烯酸的量，即為丙烯酰胺酶的含量。

1.2.5.3 電導率的測定

水合反應實驗裝置見圖1，主要裝置是三口燒瓶(5000mL)，內置發酵液細胞粒子與水的比例為1∶8，水浴控制反應溫度10℃左右，攪拌為100r/min。緩慢流加丙烯腈，底物濃度控制在4%，當產物濃度達到25%～30%左右，終止反應，取樣用電導儀測產物丙烯酰胺水溶液電導率。方法見Q/SN K002- 2000，利用此裝置測出馴化株和對照株不同細胞粒子水合反應生成丙烯酰胺的電導率。

2 結果與分析

2.1 不同丙烯酰胺濃作用下菌體存活率和腈水合酶活性變化的檢測結果

不同丙烯酰胺濃作用下菌體存活率和腈水合酶活性變化的檢測結果見表1。

隨著丙烯酰胺的積累，搖瓶培養液中活菌體數逐漸減少，特別是搖瓶培養到108～112h，菌體的存活率大幅下降，搖瓶發酵液中的丙烯酰胺濃度達到16%，發酵液活菌存活率為0.0021%，在搖瓶培養液中丙烯酰胺濃度達到18.67%，發酵液活菌存活率為零。

2.2 耐高濃度丙稀酰胺和不同低溫培養處理菌落斜面搖瓶發酵結果

從Nocardia.sp.163菌株在含有16%丙烯酰胺濃度培養到112h取發酵液稀釋10倍液涂布固體培養基平皿上分別置于不同低溫培養處理，所獲得的28個殘存菌落斜面分別進行搖瓶發酵96h后，其發酵液中的腈水合酶活性檢測結果見表2。

由表2可知，平皿在不同低溫培養下殘存所得28株菌的搖瓶發酵所產腈水合酶活性均高于Nocardia.sp.163菌株在通常28℃培養下搖瓶發酵所產腈水合酶活性，說明腈水合酶活性與其腈水合酶菌在斜面培養的溫度有關聯。在18℃、16℃、20℃、14℃和12℃低溫處理培養的菌株搖瓶發酵所腈水合酶活性平均酶活單位(萬μ/mg)分別比對照正常28℃培養的搖瓶發酵所腈水合酶活性平均酶活單位分別提高了58.24%、47.27%、45.45%、43.72%和44.14%。其中18℃培養所得的24號菌株和22號菌株的搖瓶腈水合酶酶活單位分別為1422萬μ/mg和1314萬μ/mg，比對照處理Nocardia.sp.163菌株的搖瓶腈水合酶酶活單位分別提高了76%和63%。

2.3 Nocardia.sp.163與24號菌株搖瓶發酵酰胺酶的檢測結果

Nocardia.sp.163與24號菌株搖瓶發酵酰胺酶的檢測結果見表3。

由表3可知，24菌株產酰胺酶酶活性只有Nocardia.sp.163菌株的50.77%。由于酰胺酶的存在，易導致丙烯酰胺水解形成丙烯酸，不利于丙烯酰胺的生產，故24號菌株更有利于丙烯酰胺的生產。

2.4 Nocardia.sp.163與24號菌株號電導率的測定結果

由于Nocardia.sp.163和24號菌株都能產生酰胺酶(AA)，導致生產中丙烯酰胺部分水解形成丙烯酸，影響產品質量。按照丙烯酸電導率的測定方法， Nocardia.sp.163和24號菌株水解丙烯酰胺產生丙烯酸的電導率見表4。

由表4可知，24號菌株的平均電導率為834，相比Nocardia.sp.163下降了近45%。由于在生產中電導率的高低直接影響到精制中的過料速率，電導率高，過料速率變慢，電導率越低，過料速率越快。且酶活越高，反應速率越快，有利于反應釜的利用率，同時若電導率低則精制過料速率加快，反應釜中的丙烯酰胺對發酵菌絲體的傷害減少，這樣有利于增加反應次數。24號菌株分別具有產腈水合酶酶活較高、酰胺酶和電導率較低，由于產丙烯酸降低，使得丙烯腈單耗均明顯下降。

2.5 Nocardia.sp.163和24號菌株在水合反應中的試驗結果

Nocardia.sp.163和24號菌株在水合反應中的反應次數及其放料的平均濃度檢測結果見表5。

從表5可以看出，24號菌株菌株發酵后投入水合反應平均反應次數比Nocardia.sp.163多3.33次，放料濃度高5.93%。說明24號菌株與Nocardia.sp.163菌株相比具有較高的丙烯酰胺耐受性。

3 結論

1)Nocardia.sp.163菌株搖瓶發酵96h后，分別通過發酵液中的高濃度(16%)丙烯酰胺耐受性和該發酵液涂布在固體平板上置于18℃低溫培養處理，從長出的殘存菌落斜面再分別經搖瓶發酵和檢測發酵液中腈水合酶酶活性篩選，獲得優良的24號菌株， 腈水合酶酶活性達到1422萬μ/mg，比出發Nocardia.sp.163菌株的腈水合酶酶活性807萬μ/mg提高了76%。

2)通過檢24號菌株和Nocardia.sp.163菌株發酵液中丙烯酰胺酶活性檢測和電導率(us/cm)檢測，丙烯酰胺酶活性24號菌株僅是Nocardia.sp.163菌株的50.77%，電導率24號菌株比Nocardia.sp.163菌株降低了近45%。

3)通過24號菌株和Nocardia.sp.163菌株的水合反應試驗，24號菌株水合反應反應次數增加3.33次，丙烯酰胺放料濃度由原來的26.07%提高到32.0%，提高了5.93%。

參考文獻

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