粘毛黃芩毛狀根外源基因表達系統的建立

摘要：用攜帶植物高效表達載體ｐＣＡＭＢＩＡ１３０４＋和發根型質粒ｐＲｉＡ４，“解除武裝”的重組Ｃ５８Ｃ１工程菌感染粘毛黃芩（Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ ｖｉｓｃｉｄｕｌａ Ｂｕｎｇｅ.）無菌苗的幼莖、子葉、葉片，誘導毛狀根的表達，以建立基于粘毛黃芩毛狀根的高效外源基因表達系統。幼莖毛狀根誘導率最高，達８８．９％。ＰＣＲ擴增檢測粘毛黃芩毛狀根單克隆基因組中的ｒｏｌＣ和ｈｙｇｒ基因片段，結果表明，ｐＲｉＡ４和ｐＣＡＭＢＩＡ１３０４＋均能整合到粘毛黃芩毛狀根的基因組內，共轉化率達２８．１％。

關鍵詞：粘毛黃芩（Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ ｖｉｓｃｉｄｕｌａ Ｂｕｎｇｅ.）；毛狀根；共轉化

中圖分類號：Ｓ５６７．２３＋９ 文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０11）19－4070-03

Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ Ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ bａｓｅｄ ｏｎ Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ ｖｉｓｃｉｄｕｌａ Ｈａｉｒｙ Ｒｏｏｔｓ

ＷＡＮＧ Ｓｈｕ－ｆａｎｇ１，ＬＩ Ｆｅｎｇ－ｈｕａ１，ＳＵＮ Ｍｉｎ２

（１． Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ， Ｚｕｎｙｉ Ｎｏｒｍａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｚｕｎｙｉ ５６３００２， Ｇｕｉｚｈｏｕ， Ｃｈｉｎａ；

２．Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ Ｃｈｉｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ ４００７１５， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｄｉｓａｒｍｅｄ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ｓｔｒａｉｎ Ｃ５８Ｃ１ ｈａｒｂｏｒｉｎｇ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＲｉＡ４ ａｎｄ ｐｌａｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒ ｐＣＡＭＢＩＡ１３０４＋ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｉｎｆｅｃｔ ｔｈｅ ｙｏｕｎｇ ｓｔｅｍ， ｃｏｔｙｌｅｄｏｎｓ ａｎｄ ｌｅａｖｅｓ ｏｆ Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ ｖｉｓｃｉｄｕｌａ Ｂｕｎｇｅ． ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ａ ｈｉｇｈ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ． Ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｏｆ ｈａｉｒｙ ｒｏｏｔｓ ｆｒｏｍ ｓｔｅｍｓ ｅｘｐｌａｎｔｓ ｗａｓ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ， ｗｈｉｃｈ ｒｅａｃｈｅｄ ｕｐ ｔｏ ８８．９％． Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｔｗｏ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｗａｓ ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ rｏｌＣ ａｎｄ hｙｇｒ ｇｅｎｅｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｈａｉｒｙ ｒｏｏｔｓ ｏｆ Ｓ． ｖｉｓｃｉｄｕｌａ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｂｏｔｈ ｔｈｅ ｔｗｏ ｇｅｎｅｓ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｉｎｔｏ ｈａｉｒｙ ｒｏｏｔｓ ｏｆ Ｓ． ｖｉｓｃｉｄｕｌａ， ｗｉｔｈ ａ ｃｏ－ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ ２８．１％．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ ｖｉｓｃｉｄｕｌａ Ｂｕｎｇｅ.； ｈａｉｒｙ ｒｏｏｔｓ； ｃｏ－ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ

粘毛黃芩（Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ ｖｉｓｃｉｄｕｌａ Ｂｕｎｇｅ．）是唇形科（Ｌａｂｉａｔａｅ）黃芩屬（Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ）多年生草本植物［１，２］，其藥用成分主要分布于根部。藥理上已證實其中的主要成分黃芩苷和黃芩苷元有抑菌、清熱、降壓、鎮靜、利尿、利膽、抗炎、解毒及抑制ＨＩＶ病毒逆轉錄酶活性等作用［３］。隨著對植物代謝網絡認識的加深，應用基因工程技術對植物次生代謝途徑進行遺傳改良已取得了可喜的進展。本研究用攜帶植物高效表達載體ｐＣＡＭＢＩＡ１３０４＋（攜帶一個潮霉素抗性基因ｈｙｇｒ）“解除武裝（Ｄｉｓａｒｍｅｄ）”的重組Ｃ５８Ｃ１工程菌感染粘毛黃芩無菌苗的不同外植體誘導出毛狀根，建立粘毛黃芩毛狀根的高效外源基因表達系統，以期為其次生代謝產物黃酮類化合物的生物合成關鍵酶基因導入，并實現產業化大量生產奠定基礎。

１材料與方法

１．１菌株及植物材料

重組Ｃ５８Ｃ１工程菌由西南大學廖志華教授惠贈，Ｃ５８Ｃ１本來是根癌農桿菌，經“解除武裝”改造后，保留Ｈｅｌｐｅｒ質粒，導入發根質粒ｐＲｉＡ４，改造后的Ｃ５８Ｃ１失去使植物長冠癭組織的能力，成為發根農桿菌。粘毛黃芩種子購買于山西省絳縣遠博農副產品公司。……