產(chǎn)堿性纖維素酶菌株的篩選及酶學(xué)性質(zhì)研究

摘要：從采集的造紙廠土樣中，篩選出ｌ株產(chǎn)堿性纖維素酶酶活力較高的菌株Ｈ－１，經(jīng)鑒定，該菌株為革蘭氏陽(yáng)性芽孢桿菌屬。發(fā)酵產(chǎn)酶條件和酶學(xué)性質(zhì)研究表明Ｈ－１菌株的適宜發(fā)酵條件為：接種量為６％，ｐＨ ９．０，溫度為３７ ℃，此條件下的酶活力可達(dá)８．６９ Ｕ／ｍＬ，是初始酶活力（２．９３ Ｕ／ｍＬ）的３倍。該酶最適反應(yīng)溫度為４０ ℃，最適反應(yīng)ｐＨ ９．０。在２５～５５ ℃，ｐＨ ７．０～１１．０仍能保持６０％以上的酶活力，能較好地滿足日常洗滌的環(huán)境要求。

關(guān)鍵詞：堿性纖維素酶（ＣＭＣ酶）；菌株篩選；發(fā)酵條件；酶學(xué)性質(zhì)

中圖分類號(hào)：Ｑ９３９．９６文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ文章編號(hào)：0439－８114（２０11）21－4364-04

Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ Ａｌｋａｌｉｎｅ－Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｓｔｒａｉｎ ａｎｄ Ｓｔｕｄｙ ｏｎ Ｉｔｓ Ｅｎｚｙｍａｉｃ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ

ＬＵ Ｊｉｎ－ｚｈｅｎ１，ＲＥＮ Ｊｕｎ１，ＹＡＮＧ Ｗｅｎ－ｃｈａｏ１，ＸＩＯＮＧ Ｈａｎ－ｇｕｏ２

（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｗｕｈａｎ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｗｕｈａｎ ４３０４１５，China；

２．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ and Technology， Ｈｕａｚｈｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｗｕｈａｎ ４３００７０，China）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｆｒｏｍ ｓｏｉｌ ｓａｍｐｌｅｓ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｐａｐｅｒ ｍｉｌｌｓ， ｏｎｅ ｓｔｒａｉｎ ｃａｌｌｅｄ Ｈ－１ ｃａｐａｂｌｅ ｏｆ ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｗａｓ ｓｃｒｅｅｎｅｄ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｓ Ｇｒａｍ－ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｂａｃｉｌｌｕｓ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｅｎｚｙｍｅ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｓ， ｉｎｏｃｕｌｕｍ ａｍｏｕｎｔ ６％， ｐＨ ９．０ ， ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ３７ ℃． Ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗａｓ ｕｐ ｔｏ ８．６９ Ｕ／ｍＬ， ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ３ ｔｉｍｅｓ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｅ ｉｎｉｔｉａｌ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ（２．９３ Ｕ／ｍＬ）． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ａｂｏｕｔ ４０ ℃ ａｎｄ ｐＨ ９．０． Ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｍａｉｎｔａｉｎｅｄ ａｂｏｖｅ ６０％ ａｔ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ２５～５５℃ ａｎｄ ｐＨ ７．０～１１．０， which ｍｅｅｔ ｔｈｅ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｄａｉｌｙ ｗａｓｈｉｎｇ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： aｌｋａｌｉｎｅ－ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ enzyme（ＣＭＣ ｅｎｚｙｍｅ）； strain sｃｒｅｅｎｉｎｇ； ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ； ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅ

纖維素酶的研究一般都以有效利用纖維素資源為主，酶作用的ｐＨ多為酸性，當(dāng)添加到洗滌劑中，由于所處環(huán)境為堿性而失去活力，不能發(fā)揮作用［１］。近年來(lái)堿性纖維素酶的發(fā)現(xiàn)使其在洗滌工業(yè)中得到成功應(yīng)用。堿性纖維素酶是纖維素酶系的一個(gè)組分，即羧甲基纖維素酶（ＣＭＣ酶），它不含有纖維素酶系的其他兩個(gè)組分（外切－β－１，４－葡聚糖苷酶和β－葡萄糖苷酶），能作用于底物ＣＭＣ（一般用羧甲基纖維素的鈉鹽）。ＣＭＣ屬大分子多糖衍生物，它被降解后生成多種相對(duì)分子質(zhì)量不等的低聚糖。堿性纖維素酶在對(duì)天然纖維素（棉纖維）作用的過(guò)程中不能發(fā)生酶組分間的協(xié)同效應(yīng)，不會(huì)使棉纖維受到較多的分解破壞［２，３］。它主要對(duì)棉纖維中占1０％左右非結(jié)晶區(qū)的纖維素分子起作用，對(duì)結(jié)晶區(qū)纖維素水解活力很低，因此不會(huì)明顯降低棉纖維的牢固度，并能去除侵入衣物內(nèi)部的塵泥皮脂，顯著提高洗滌效果，節(jié)約洗滌活性物用量，減少環(huán)境污染，是目前世界洗滌工業(yè)發(fā)展的趨勢(shì)［４］。因此研究和開(kāi)發(fā)堿性纖維素酶產(chǎn)品具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

本試驗(yàn)從堿性土壤中篩選出1株產(chǎn)堿性纖維素酶的野生菌株，并對(duì)其搖瓶發(fā)酵產(chǎn)酶條件和酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究，以期為工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的理論參考。

１材料與方法

１．１材料

１．１．１土樣來(lái)源取自湖北省武漢市陽(yáng)邏、黃陂等地造紙廠的堿性土壤。

１．１．２培養(yǎng)基斜面保藏培養(yǎng)基配方（每升用量，下同）為：羧甲基纖維素鈉１０ ｇ，酵母膏４ ｇ，牛肉膏５ ｇ，蛋白胨５ ｇ，ＮａＣｌ ５ ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ １ ｇ，瓊脂粉１５ ｇ，０．２ ｍｏｌ／Ｌ氫氧化鈉調(diào)至ｐＨ ９．０。分離培養(yǎng)基Ａ：蛋白胨１０ ｇ，酵母膏１０ ｇ，羧甲基纖維素鈉１０ ｇ，ＮａＣｌ ５ ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ １ ｇ，瓊脂粉１５ ｇ，０．２ ｍｏｌ／Ｌ氫氧化鈉調(diào)至ｐＨ ９．０。分離培養(yǎng)基Ｂ：ＫＨ２ＰＯ４ ２ ｇ，（ＮＨ４）２ＳＯ４ １．４ ｇ，ＭｇＳＯ４ ０．３ ｇ，ＣａＣｌ２ ０．３ ｇ，ＦｅＳＯ４ ０．００５ ｇ，ＭｎＳＯ４ ０．００１ ６ ｇ，ＺｎＣｌ２ ０．００１ ７ ｇ，ＣｏＣｌ２ ０．００２ ｇ，ＣＭＣ ２ ｇ，瓊脂粉１５ ｇ，０．２ ｍｏｌ／Ｌ氫氧化鈉調(diào)至ｐＨ ９．０。種子培養(yǎng)基：可溶性淀粉１５ ｇ，酵母膏１０ ｇ，ＣＭＣ ５ ｇ，ＫＮＯ３ １ ｇ，ＭｇＳＯ４ ０．５ ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４ ０．５ ｇ，ＦｅＳＯ４ ０．０１ ｇ，０．２ ｍｏｌ／Ｌ氫氧化鈉調(diào)至ｐＨ ９．０。發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基：可溶性淀粉１０ ｇ，酵母膏１０ ｇ，ＣＭＣ １０ ｇ，ＫＮＯ３ １ ｇ，ＭｇＳＯ４ ０．５ ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４ ０．５ ｇ，ＦｅＳＯ４ ０．０１ ｇ，０．２ ｍｏｌ／Ｌ氫氧化鈉調(diào)至ｐＨ ９．０。

１．２方法

１．２．１菌種的初篩采用剛果紅染色鑒定法［５，６］。稱?。?ｇ土樣懸浮于１０ ｍＬ無(wú)菌生理鹽水中，振蕩混勻，適當(dāng)稀釋后，吸?。埃?ｍＬ土壤懸液涂布于分離培養(yǎng)基Ａ上，３７ ℃恒溫培養(yǎng)２ ｄ。待長(zhǎng)出單菌落后挑取單菌落接種于斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)和保存，將保存的單菌落稀釋涂布于分離培養(yǎng)基Ｂ上，３７ ℃恒溫培養(yǎng)２ ｄ。往平板中加入適量１ ｍｇ／ｍＬ的剛果紅溶液染色１ ｈ，棄去染液，用適量１ ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＣｌ溶液洗滌１ ｈ。篩選能產(chǎn)生較大透明水解圈的菌株，接種到斜面培養(yǎng)基中保存。

１．２．２搖瓶發(fā)酵復(fù)篩將分離得到產(chǎn)ＣＭＣ酶的菌株活化后接入種子培養(yǎng)基，于３７ ℃、２００ ｒ／ｍｉｎ培養(yǎng)２ ｄ，再將種子液按６％接種量接種于發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，于３７ ℃、２００ ｒ／ｍｉｎ培養(yǎng)５ ｄ，所得發(fā)酵液于４ ℃、４ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心1０ ｍｉｎ，取上清液測(cè)定ＣＭＣ酶活力。

１．２．３３，５－二硝基水楊酸（ＤＮＳ）試劑的配制稱?。常担趸畻钏幔玻?ｇ，溶入５００ ｍＬ去離子水中加熱（溫度不超過(guò)５０ ℃），于熱溶液中依次加入苯酚４ ｇ，亞硫酸鈉１ ｇ，酒石酸鉀鈉４００ ｇ，上述藥品溶于１ Ｌ 質(zhì)量濃度為２0 g/L ＮａＯＨ溶液中，再用去離子水稀釋至２ Ｌ，放置一周后，過(guò)濾除去不溶物，待標(biāo)定。

１．２．４酶活力的測(cè)定ＣＭＣ酶活力采用ＤＮＳ法測(cè)定［７］。用ｐＨ ９．０的０．０５ ｍｏｌ／Ｌ甘氨酸－ＮａＯＨ緩沖液制備質(zhì)量濃度為１％的ＣＭＣ－Ｎａ溶液，取該溶液２．０ ｍＬ于２５ ｍＬ刻度試管中，加入適當(dāng)稀釋的酶液０．５ ｍＬ在特定條件下反應(yīng)３０ ｍｉｎ，加入ＤＮＳ試劑３．０ ｍＬ，將試管放入沸水浴中加熱１０ ｍｉｎ，取出后迅速冷卻至室溫，用去離子水定容至２５ ｍＬ，于５４０ ｎｍ測(cè)定還原糖量?？瞻讓?duì)照中先加ＤＮＳ再加酶液，其余步驟相同。在此條件下，每分鐘水解ＣＭＣ產(chǎn)生１ μｍｏｌ葡萄糖的酶量，定義為一個(gè)酶活力單位，用 Ｕ／ｍＬ表示。ＣＭＣ糖化力、濾紙?zhí)腔?、ＣＭＣ液化力的測(cè)定方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)［８］。以上試驗(yàn)重復(fù)３次，取平均值。

１．２．５搖瓶發(fā)酵條件和酶學(xué)性質(zhì)研究將分離菌株Ｈ－１由斜面接至５０ ｍＬ（２５０ ｍＬ三角瓶）種子培養(yǎng)基中，于３７ ℃， ２００ ｒ／ｍｉｎ條件下培養(yǎng)２ ｄ，制成種子液，并于不同的接種量、溫度和ｐＨ條件下，接入發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中以２００ ｒ／ｍｉｎ進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶試驗(yàn)，定時(shí)取樣于４ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心ｌ ０ ｍｉｎ，離心后取上清液測(cè)定發(fā)酵液中的ＣＭＣ酶活力。取最適發(fā)酵條件下的發(fā)酵液在４ ℃下，于４ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心1０ ｍｉｎ，取上清液，研究不同溫度、ｐＨ條件下的ＣＭＣ酶穩(wěn)定性。

２結(jié)果與分析

２．１ＣＭＣ酶產(chǎn)生菌的篩選

利用分離培養(yǎng)基Ｂ經(jīng)過(guò)初篩分離到能夠產(chǎn)生透明圈的６株菌株，其編號(hào)分別為Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｈ－１、Ｄ、Ｅ。將各菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，測(cè)定ＣＭＣ酶活力，結(jié)果（表１）表明，菌株Ｈ－１的初始酶活力最高，達(dá)到２．９３ Ｕ／ｍＬ。因此以Ｈ－１為出發(fā)菌株進(jìn)行進(jìn)一步研究。

２．２菌株Ｈ－１的初步鑒定

將篩選到的菌株Ｈ－１在分離培養(yǎng)基Ｂ上培養(yǎng)２ ｄ后，觀察菌落的形態(tài)特征，結(jié)果表明，菌落扁平、灰白色、邊緣波紋狀、較粘稠；革蘭氏染色和顯微鏡觀察結(jié)果表明，細(xì)胞呈桿狀、革蘭氏染色陽(yáng)性、有芽孢形成，初步鑒定為芽孢桿菌屬［６］。穿刺培養(yǎng)結(jié)果表明該菌株在厭氧條件下無(wú)法生長(zhǎng)，為好氧菌。

２．３菌株Ｈ－１產(chǎn)生酶的酶系組成

纖維素酶是降解纖維素生成葡萄糖的一組酶的總稱，包括外切－β－１，４－葡聚糖苷酶、內(nèi)切－β－１，４－葡聚糖苷酶和β－葡萄糖苷酶。ＣＭＣ糖化力主要代表外切和內(nèi)切酶活力的總和；ＣＭＣ液化力可用來(lái)表征內(nèi)切酶的活力；濾紙?zhí)腔t反映了３類酶組分的協(xié)同作用［９］。對(duì)菌株Ｈ－１的粗酶液分別進(jìn)行ＣＭＣ糖化力、濾紙?zhí)腔?、ＣＭＣ液化力測(cè)定，結(jié)果分別為５．２２、３．８９、４．２０ Ｕ／ｍL， 其中濾紙?zhí)腔ψ畹?，說(shuō)明菌株Ｈ－１所產(chǎn)生的酶不包括β－葡萄糖苷酶，ＣＭＣ糖化力與ＣＭＣ液化力相差不大，可見(jiàn)菌株Ｈ－１產(chǎn)生的大部分是內(nèi)切酶。這種酶系組成上的不完全，恰恰使它在棉紡織品生物整理工藝中具有獨(dú)特用途，減少了酶制劑對(duì)織物的損害作用［１０－１２］。

２．４菌株Ｈ－１的搖瓶發(fā)酵產(chǎn)酶條件

２．４．１溫度的影響將菌株Ｈ－１接入發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，于不同溫度條件下振蕩培養(yǎng)５ ｄ，測(cè)定ＣＭＣ酶活力，結(jié)果見(jiàn)圖１。由圖１可知，在３７ ℃時(shí)，最有利于菌體產(chǎn)酶活力的提高，溫度由２０ ℃升至３７ ℃時(shí)，酶活力由０．４４ Ｕ／ｍＬ迅速上升至３．５６ Ｕ／ｍＬ；但當(dāng)溫度超過(guò)３７ ℃時(shí)，酶活力又顯著下降，說(shuō)明溫度對(duì)該菌株產(chǎn)堿性纖維素酶的影響比較大，溫度高于或者低于３７ ℃，可能會(huì)影響ＣＭＣ酶的合成，使酶活力下降。

２．４．２ｐＨ的影響將菌株Ｈ－１接入不同初始ｐＨ的發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，３７ ℃振蕩培養(yǎng)５ ｄ，測(cè)定ＣＭＣ酶活力，結(jié)果見(jiàn)圖２。由圖２可知，該菌在初始ｐＨ為９．０時(shí)酶活力達(dá)到最高值８．６９ Ｕ／ｍＬ。當(dāng)ｐＨ由８．０上升到９．０時(shí)，酶活力上升迅速；ｐＨ超過(guò)９．０后，酶活力雖有下降，但趨勢(shì)較平緩，說(shuō)明在堿性條件（ｐＨ＞９．０）下，該菌株產(chǎn)酶活力較穩(wěn)定。

２．４．３接種量的影響將菌株Ｈ－１種子液以不同接種量接入ｐＨ ９．０的發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，３７ ℃振蕩培養(yǎng)５ ｄ，測(cè)定ＣＭＣ酶活力，結(jié)果見(jiàn)圖３。由圖３可知，當(dāng)接種量為６％時(shí)，酶活力最高。接種量過(guò)低，發(fā)酵培養(yǎng)基中菌體濃度過(guò)低，不利于產(chǎn)酶；接種量過(guò)高時(shí)，可能由于溶氧量不足導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)受阻而抑制酶的產(chǎn)生。

２．５ＣＭＣ酶的酶學(xué)性質(zhì)

２．５．１ＣＭＣ酶反應(yīng)的最適溫度在１０～７０ ℃范圍內(nèi)，以５ ℃為間隔，在不同的溫度條件下測(cè)定ＣＭＣ酶活力，結(jié)果見(jiàn)圖４。由圖４可知，該酶的最適反應(yīng)溫度為４０ ℃， 在３０～４０ ℃間具有相對(duì)較高的酶活力。超過(guò)４０ ℃后，酶活力下降，可能是因?yàn)闇囟冗^(guò)高會(huì)使酶蛋白變性。

２．５．２ＣＭＣ酶的熱穩(wěn)定性酶液在１０～７０ ℃范圍內(nèi)，以５ ℃為間隔，在不同溫度下保溫６０ ｍｉｎ后，在４０ ℃條件下測(cè)定其剩余ＣＭＣ酶活力，結(jié)果見(jiàn)圖５。由圖５可知，酶液在２５～５５ ℃范圍內(nèi)均可保持６０％以上的活性，即該酶在２５～５５ ℃下具有較好的熱穩(wěn)定性，可以適應(yīng)較寬的洗滌溫度范圍。

２．５．３ＣＭＣ酶反應(yīng)的最適ｐＨ將酶液分別置于不同的ｐＨ條件下測(cè)定ＣＭＣ酶活力，結(jié)果見(jiàn)圖６。由圖６可知，該酶的最適反應(yīng)ｐＨ為９．０，且在ｐＨ ７．０～１１．０范圍內(nèi)具有較高的酶活力。

２．５．４ＣＭＣ酶的ｐＨ穩(wěn)定性將酶液置于不同ｐＨ環(huán)境中，于４０ ℃保溫６０ ｍｉｎ，測(cè)其剩余ＣＭＣ酶活力，結(jié)果見(jiàn)圖７。由圖７可知，在ｐＨ ７．０～１１．０的范圍內(nèi)，酶活力均可保持在６０％以上，說(shuō)明該菌株產(chǎn)生的ＣＭＣ酶在中、堿性條件下具有較好的穩(wěn)定性。

３結(jié)論

１）篩選的野生菌株Ｈ－１為革蘭氏陽(yáng)性芽孢桿菌，該菌株能產(chǎn)生不包括β－葡萄糖苷酶的堿性纖維素酶，從而能夠更好地應(yīng)用于洗滌工業(yè)。

２）菌株Ｈ－１的適宜發(fā)酵產(chǎn)酶條件為：接種量為６％，ｐＨ ９．０，３７ ℃振蕩培養(yǎng)５ ｄ，酶活力可提高到８．６９ Ｕ／ｍＬ，是初始酶活力的３倍。

３）ＣＭＣ酶的最適反應(yīng)溫度為４０ ℃，最適反應(yīng)ｐＨ為９．０，在２５～５５ ℃、ｐＨ ７．０～１１．０仍能保持６０％以上的酶活力。

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