黃鱔載脂蛋白apoAI基因的克隆及序列分析

摘要：以黃鱔（Ｍｏｎｏｐｔｅｒｕｓ ａｌｂｕｓ）肝臟為研究材料，提取總ＲＮＡ，利用同源克隆技術獲得了黃鱔的載脂蛋白ａｐｏＡＩ基因的部分編碼區（ＧｅｎＢａｎｋ登錄號：ＨＱ６０３７８２）和３′ＵＴＲ，其ｃＤＮＡ序列長度為１ １４５ ｂｐ，其中編碼區長度為７７２ ｂｐ，編碼２５６個氨基酸。序列同源性分析表明，黃鱔的ａｐｏＡＩ基因的氨基酸序列與其他魚類的ａｐｏＡＩ基因的氨基酸序列具有非常高的同源性，是載脂蛋白家族的一個新成員。黃鱔ａｐｏＡＩ基因的克隆為進一步深入研究該基因的功能積累了基礎資料，在黃鱔育種及醫藥研制方面具有潛在的應用價值。

關鍵詞：黃鱔（Ｍｏｎｏｐｔｅｒｕｓ ａｌｂｕｓ）；載脂蛋白；ａｐｏＡＩ；克?。恍蛄蟹治?/p>

中圖分類號：Ｑ７８５；Ｑ９５９．４８２文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）21－4500-03

Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Aｎ ａｐｏＡＩ Ｇｅｎｅ ｉｎ Ｒｉｃｅ Ｆｉｅｌｄ Ｅｅｌ

Ｍｏｎｏｐｔｅｒｕｓ ａｌｂｕｓ

ＱＩＵ Ｑｉｎｇ－ｃｈｏｎｇ，ＧＥＮＧ Ｘｉａｏ－ｘｕｅ，ＬＩＵ Ｃｈｅｎｇ－ｄｕ，ＳＵＮ Ｗｅｎ－ｘｉｕ

（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｙａｎｇｔｚｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｊｉｎｇｚｈｏｕ ４３４０２５， Ｈｕｂｅｉ， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｐａｒｔ ｏｆ ｃｏｄｉｎｇ ａｎｄ ３′ ＵＴＲ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ａｐｏＡＩ ｇｅｎｅ （ＧｅｎBａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ： ＨＱ６０３７８２） ｗａｓ ｃｌｏｎｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｔｏｔａｌ ｌｉｖｅｒ ＲＮＡ ｏｆ ｒｉｃｅ ｆｉｅｌｄ ｅｅｌ （Ｍｏｎｏｐｔｅｒｕｓ ａｌｂｕｓ）． Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｌｅｎｇｔｈ ｏｆ ｔｈｉｓ ｃＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ waｓ １ １４５ ｂｐ， ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ７７２ ｂｐ ｃｏｄｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ ａｎｄ ｅｎｃｏｄｅｄ ２５６ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ． Ｈｏｍｏｌｏｇｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ｈｉｇｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ Ｍｏｎｏｐｔｅｒｕｓ ａｌｂｕｓ ａｎｄ other ｆｉｓｈｅｓ’ ａｐｏＡＩ ｇｅｎｅｓ， ｗｈｉｃｈ were ｂｅｌｏｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｆａｍｉｌｙ． Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｏｎｏｐｔｅｒｕｓ ａｌｂｕｓ’ ａｐｏＡＩ ｇｅｎｅ ｇａｖｅ ｔｈｅ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｆｕｒｔｈｅｒ ｉｎｖｅｒｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｉｔｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎ， ａｎｄ ｈａd ｔｈｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ Ｍｏｎｏｐｔｅｒｕｓ ａｌｂｕｓ’ ｂｒｅｅｄｉｎｇ ａｎｄ ｍｅｄｉｃａｌ ｕｓａｇｅ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｍｏｎｏｐｔｅｒｕｓ ａｌｂｕｓ； ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ； ａｐｏＡＩ； ｃｌｏｎｉｎｇ； ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ

黃鱔廣泛分布于亞洲東南部，是一種普遍的淡水食用魚，具有很高的營養價值和經濟價值，現已成為長江流域主要省分水產養殖業的主導產業之一［１］。黃鱔的飼料代謝對黃鱔的科學養殖具有重要意義，一直是生產實踐和科研工作的難點和熱點之一［２－４］。許多學者研究了飼料中的蛋白質和脂肪含量對黃鱔生長的影響，但由于受黃鱔規格、飼料中的脂肪來源以及實驗水溫等因素的影響，其結果存在較大差異［２，４，５］。有研究［６］指出，飼料中的能量和蛋白質含量與動物機體的脂類代謝密切相關。因此，尋找與脂類代謝相關的生理指標對于確立飼料中蛋白質和脂肪對黃鱔生長的影響具有重要的意義。載脂蛋白是攜帶脂肪的主要載體，是構成血漿脂蛋白的蛋白質組分，其基本功能是運載脂類物質及穩定脂蛋白的結構，某些載脂蛋白還具有激活脂蛋白代謝酶、識別受體等功能［７］。在各種載脂蛋白中，載脂蛋白ＡＩ（Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ＡＩ）是一種主要的載脂蛋白，其可能是參與脂蛋白代謝和維持正常血清脂類代謝平衡的核心載脂蛋白［８］。目前，與黃鱔脂類代謝相關的載脂蛋白基因及其功能的研究鮮見報道。本研究以黃鱔肝臟為研究材料，通過同源克隆獲得了其載脂蛋白ａｐｏＡＩ基因的序列，并對其ｃＤＮＡ序列進行了分析，以期為深入研究黃鱔載脂蛋白ａｐｏＡＩ基因的功能提供基礎資料。

１材料與方法

１．１實驗材料

實驗用黃鱔購自荊州市西門菜市場，質量約１００ ｇ，解剖后取其肝臟并迅速放入液氮中冷凍，然后轉入－８０ ℃超低溫冰箱中保存備用。提取ＲＮＡ所用的Ｔｒｉｚｏｌ和ＡＭＶ Ｒｅｒｖｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓ購自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；ｐＭＤ１８－Ｔ載體、ｒＴａｑ ＤＮＡ聚合酶、ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ ＤＬ２０００等購自ＴａＫａＲａ公司；ＤＮＡ凝膠回收試劑盒購自Ｏｍｅｇａ公司；Ｘ－ｇａｌ、ＩＰＴＧ、瓊脂糖、酵母提取物、胰蛋白胨等購自Ｐｒｏｍｅｇａ公司；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ ５α為長江大學生命科學學院分子生物學實驗室保存；其余生化試劑均為國產分析純。

１．２方法

１．２．１引物設計及合成參照已報道的其他魚類的ａｐｏＡＩ基因設計了１對簡并引物用來擴增黃鱔的ａｐｏＡＩ基因，引物序列為ＡＰＯ１（上游引物）５′－ＣＣＴＣＴＫＧＣＴＣＣＴＧＣＴＧＧＣＴＴＴＣ－３′ 和ＡＰＯ２（下游引物）５′－ＴＧＣＣＧＡＡＴＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＧＣ－３′。引物由ＴａＫａＲａ公司合成，用無菌水稀釋成１００ ｐｍｏｌ／Ｌ，置于－２０ ℃冰箱備用。

１．２．２黃鱔肝組織ＲＮＡ的提取及ＲＴ－ＰＣＲ反應黃鱔肝組織的總ＲＮＡ提取采用Ｔｒｉｚｏｌ試劑盒，按說明書進行。ＲＴ－ＰＣＲ反應參照ＴａＫａＲａ ＲＮＡ ＰＣＲ Ｋｉｔ （ＡＭＶ） Ｖｅｒ ３．０試劑盒的說明書進行。在１０ μＬ的反轉錄體系中分別加入以下組分：ＭｇＣｌ２ ２ μＬ、１０× ＲＴ Ｂｕｆｆｅｒ １ μＬ、ＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ ｄＨ２Ｏ ３．７５ μＬ、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（均為１０ ｍｍｏｌ／Ｌ）１ μＬ、ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ０．２５ μＬ、ＲＮＡ １ μＬ、ＡＭＶ Ｒｅｒｖｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ０．５ μＬ、Ｏｌｉｇｏ ｄＴ－Ａｄａｐｔｏｒ ｐｒｉｍｅｒ ０．５ μＬ。ＲＴ－ＰＣＲ的反應條件為：３０ ℃ １０ ｍｉｎ，４５ ℃ ３０ ｍｉｎ，９９ ℃ ５ ｍｉｎ，５ ℃ ５ ｍｉｎ。

根據反轉錄試劑盒說明書配制ＰＣＲ反應體系，包括ｃＤＮＡ ５ μＬ、５× ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ５ μＬ、ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ ０．１２５ μＬ、上游引物０．２５ μＬ、下游引物０．２５ μＬ、滅菌蒸餾水１４．３７５ μＬ。ＰＣＲ反應條件為：９４ ℃預變性２ ｍｉｎ；９４ ℃變性３０ ｓ，５４ ℃退火３０ ｓ，７２ ℃延伸２ ｍｉｎ，共３５個循環；最后于７２ ℃延伸１０ ｍｉｎ。擴增產物用質量濃度為１％的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

１．２．３黃鱔ａｐｏＡＩ基因的克隆及序列分析ＰＣＲ擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳分離后，切取目的條帶，進行回收純化?；厥盏模模危僚cｐＭＤ１８－Ｔ載體連接。重組質粒轉化到感受態Ｅ． ｃｏｌｉ ＤＨ ５α細胞中，均勻涂在含氨芐青霉素、ＩＰＴＧ和Ｘ－ｇａｌ的ＬＢ平板上，３７ ℃過夜培養。隨機挑取白色菌落，用菌液ＰＣＲ法篩選陽性克隆，并送交上海博尚公司進行測序。

采用ＤＮＡＭＡＮ軟件將所得到的ＤＮＡ序列翻譯成氨基酸序列，并將其與從ＧｅｎＢａｎｋ中獲取的其他魚類基因的氨基酸序列進行多重比對。運用ＭＥＧＡ２軟件中的Ｎ－Ｊ法構建系統進化樹。

２結果與分析

２．１黃鱔ａｐｏＡＩ基因的ｃＤＮＡ擴增

通過Ｔｒｉｚｏｌ提取的總ＲＮＡ保持完整，進行反轉錄后用上述設計的簡并引物擴增ｃＤＮＡ，產物用質量濃度為１％的瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖１所示，目的片段長約１ ２００ ｂｐ，和預計擴增大小相符。

２．２黃鱔ａｐｏＡＩ基因ｃＤＮＡ測序結果

將用引物ＡＰＯ１和ＡＰＯ２擴增得到的ｃＤＮＡ片段連接到載體ｐＭＤ１８－Ｔ上，通過質粒擴增及酶切鑒定的陽性轉化子送公司測序得到了一個長度為

１ １４５ ｂｐ的片段（圖２），其序列已提交至GenBank，登錄號為HQ603782。在本實驗中，根據其他魚類的ａｐｏＡＩ基因所設計的上游引物位于基因的編碼區，而下游引物位于基因的３′ ＵＴＲ。因此，擴增得到的１ １４５ ｂｐ的基因片段應包含部分的編碼區和３′ ＵＴＲ。序列分析表明，該基因片段含有的編碼區長度為７７２ ｂｐ，編碼２５６個氨基酸，３′ ＵＴＲ長３７３ ｂｐ，并且在３′ ＵＴＲ區域有典型的真核生物加尾信號ＡＡＴＡＡＡ。因此，實驗所獲得的序列可能包含ａｐｏＡＩ基因完整的３′ ＵＴＲ區域。

２．３黃鱔ａｐｏＡＩ基因的進化分析

將預測得到的ａｐｏＡＩ基因的氨基酸序列與其他魚類ａｐｏＡＩ基因的氨基酸序列進行了同源性比對，其同源性非常高；利用Ｎ－Ｊ法構建了系統進化樹（圖３）。結果表明，裸蓋魚、石鯛魚、牙鲆、星斑川鰈、軍曹魚、斜帶石斑魚、鱔魚７種魚聚為一類，虹鱒、花■、斑點叉尾■３種魚聚為一類。由此可見，ａｐｏＡＩ基因在不同物種間存在一定的差異，但各物種間的遺傳差異并不太大，充分體現了ａｐｏＡＩ基因在物種遺傳進化中的高度保守性，這與ａｐｏＡＩ基因的作用是緊密相連的。

３討論

載脂蛋白ＡＩ是高密度脂蛋白（ＨＤＬ）中的主要成分，幾乎所有的ＨＤＬ均含有載脂蛋白ＡＩ，其水平可直接反映體內ＨＤＬ的水平，且對ＨＤＬ的功能至關重要［７］。載脂蛋白在脂蛋白代謝中具有重要的生理功能。醫學研究發現，載脂蛋白ＡＩ具有多種生理功能，包括抗動脈粥樣硬化、抗氧化、抗炎以及抗內毒素作用［９，１０］，甚至基于載脂蛋白ＡＩ能與肝細胞表面受體特異性結合的特性，可以將其作為靶向藥物的載體［１１］，因此被認為是ＨＤＬ功能的主要承擔者。許多學者在飼料中脂肪含量對黃鱔生長的影響方面開展了大量的研究工作并獲得了不少成果，但其結果存在較大差異。目前，通過測定黃鱔內源載脂蛋白分子活性來反映飼料中脂肪和蛋白質含量對黃鱔生長的影響的研究尚未見報道；而且，關于黃鱔載脂蛋白基因的研究報道也較少。本研究利用ＲＴ－ＰＣＲ及Ｔ－Ａ克隆技術得到了黃鱔ａｐｏＡＩ基因的部分編碼區，其ｃＤＮＡ序列長１ １４５ ｂｐ，編碼２５６個氨基酸；序列同源性分析表明，該基因屬于載脂蛋白家族的新成員。黃鱔ａｐｏＡＩ基因的克隆為進一步深入研究該基因的功能積累了基礎資料，在動物育種及醫藥研制方面具有潛在的應用價值。

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