豬卵母細(xì)胞不同孤雌激活方法的研究

摘要：通過對(duì)不同電激活參數(shù)的摸索，電激活和化學(xué)激活聯(lián)合的研究，以確定適合于豬卵母細(xì)胞孤雌激活的最佳方案。結(jié)果表明，體外成熟豬卵母細(xì)胞在電場(chǎng)時(shí)程６０ μｓ，１次直流脈沖的條件下，電場(chǎng)強(qiáng)度１．６ ｋＶ／ｃｍ時(shí)其卵裂率（８８．６８％）和桑葚胚率（８1．１３％）較其他各組高。在電場(chǎng)強(qiáng)度為１．６ ｋＶ／ｃｍ，１次直流脈沖的條件下，脈沖時(shí)程２０ μｓ時(shí)，卵母細(xì)胞卵裂率僅為７５．３８％，桑葚胚率為６４．６２％；４０和８０ μｓ時(shí)，卵裂率分別是８４．６２％和７７．１７％；１００ μｓ時(shí)，卵母細(xì)胞的卵裂率和桑葚胚率都明顯下降。在電場(chǎng)強(qiáng)度為１．６ ｋＶ／ｃｍ，電場(chǎng)時(shí)程為６０ μｓ的條件下，２次電脈沖激活卵母細(xì)胞的卵裂率（８７．５０％）、桑葚胚率（８１．２５％）和１次電脈沖的卵裂率（８８．６８％）、桑葚胚率（８０．１３％）之間無(wú)顯著性差異（Ｐ﹥０．０５），但兩者均顯著高于３次電脈沖的卵裂率（７２．５０％）和桑葚胚率（70．27％）。成熟卵母細(xì)胞經(jīng)電刺激（ＥＳ）后，分別用ＣＢ（７．５ μｇ／ｍＬ）、ＣＨＸ（１０ μｇ／ｍＬ）、6-ＤＭＡＰ（２ ｍｍｏｌ／Ｌ）、ＣＢ（７．５ μｇ／ｍＬ）＋ＣＨＸ（１０ μｇ／ｍＬ）、ＣＢ（７．５ μｇ／ｍＬ）＋6-ＤＭＡＰ（２ ｍｍｏｌ／Ｌ）各自處理４ ｈ，ＥＳ＋ＣＢ＋ＣＨＸ和ＥＳ＋ＣＢ＋6-ＤＭＡＰ組卵裂率顯著高于其他３組，但其桑葚胚率差異不顯著。結(jié)果顯示，電場(chǎng)強(qiáng)度為１．６ ｋＶ／ｃｍ，電場(chǎng)時(shí)程６０ μｓ，１次脈沖的電刺激對(duì)體外成熟的豬卵母細(xì)胞（ＩＶＭ）孤雌激活效果最好；１次或２次電脈沖就足以激活豬卵母細(xì)胞，過高脈沖對(duì)細(xì)胞反而有傷害作用；電激活和化學(xué)激活聯(lián)合應(yīng)用可提高豬卵母細(xì)胞的卵裂率。

關(guān)鍵詞：卵母細(xì)胞；體外培養(yǎng)；孤雌激活；豬

中圖分類號(hào)：Ｑ１３２；S828文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ文章編號(hào)：0439－８114（２０11）21－4431-04

Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｐａｒｔｈｅｎｏｇｅｎｅｔｉｃ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｏｏｃｙｔｅｓ

ＬＩ Ｌｉ１，ＺＨＥＮＧ Ｘｉｎ－ｍｉｎ１，ＨＵＡ Ｚａｉ－ｄｏｎｇ２，ＬＩＵ Ｘｉ－ｍｅｉ１，ＢＩ Ｙａｎ－ｚｈｅｎ１，ＸＩＡＯ Ｈｏｎｇ－ｗｅｉ１

（１． Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Animal Husbandry and Veterinary， Ｈｕｂｅｉ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｃｉｅｎｃｅs／Ｈｕｂｅｉ Ｋｅｙ Ｌａｂoratory ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｅｍｂｒｙｏ Engineering and Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ， Ｗｕｈａｎ ４３００６４， Ｃｈｉｎａ； ２． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｇｕｉｚｈｏｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ / Ｇｕｉｚｈｏｕ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Bｒｅｅｄｉｎｇ ａｎｄ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ， Ｇｕｉｙａｎｇ ５５００２５， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｔ ｓｔｕｄｙ， ｔｈｅ parameters ｏｆ ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ activation ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ of electrical activation and chemical activation ｏｎ ｐａｒｔｈｅｎｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍａｔｕｒｅｄ ｐｏｒｃｉｎｅ ｏｏｃｙｔｅｓ ｗｅｒｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ to find the best program． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｒａｔｅs ｏｆ ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ ｍｏｒｕｌａ ｏｆ ｔｈｅ ｏｏｃｙｔｅｓ ｕｓｉｎｇ ｏｎｅ ＤＣ－ｐｕｌｓｅ ｏｆ １．６ kＶ／ｃｍ ｆｏｒ ６０ μｓ （８８．６８% ａｎｄ ８1．１３％） ｗｅｒｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ that in ｔｈｅ ｏｔｈｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｇｒｏｕｐｓ． Ｔｈｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｐａｒａｍｅｔｅｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｒａｔｅs ｏｆ ｃｌｅａｖａｇｅ ｉｎ ｏｎｅ， ｄｏｕｂｌｅ ａｎｄ ｔｈｒｅｅ ＤＣ－ｐｕｌｓｅ ｏｆ １．６ kＶ／ｃｍ ｆｏｒ ６０ μｓ ｗｅｒｅ ８８．６８%， ８７．５０% ａｎｄ ７２．５０％， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． And the rates of morula were 80.13%， 81.25%， 65.00% respectively. The rates of cleavage and morula of the oocytes using one DC-pulse of 1.6kV/cm for 20 μｓ were 75.38%， 64.62% respectively， while for 40 and 80 μｓ， the rates of cleavage were 84.62% and 77.17% respectively. For 100 μｓ， the rates of cleavage and morula decreased remarkably. Ｉｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｄｏｕｂｌｅ ＤＣ－ｐｕｌｓｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｇｒｏｕｐｓ ｗｅｒｅ ｎｏ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｏｓｅ ｏｆ ｏｎｅ ＤＣ－ｐｕｌｓｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｇｒｏｕｐｓ（Ｐ＞０．０５）， ｂｕｔ ｂｏｔｈ ｗｅｒｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｒｅｅ ＤＣ－ｐｕｌｓｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｇｒｏｕｐｓ， ｔｈｅ ｍｏｒｕｌａ ｒａｔｅ ｏｆ ｔｈｅｍ ｗｅｒｅ ａｌｓｏ significant ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ＤＣ－ｐｕｌｓｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｇｒｏｕｐｓ． Ａｆｔｅｒ ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ activation ｔｈｅ ｏｏｃｙｔｅｓ ｗｅｒｅ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＣＢ（7.5 μg/mL）， ＣＨＸ（10 μg/mL）， ６－ＤＭＡＰ（2 mmol/L）， ＣＢ（7.5 μg/mL）＋ＣＨＸ（10 μg/mL） ａｎｄ ＣＢ（7.5 μg/mL）＋６－ＤＭＡＰ（2 mmol/L） ４ ｈｏｕｒｓ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ activation ｗｉｔｈ ｏｎｅ ＤＣ－ｐｕｌｓｅ ｏｆ １．６ kＶ／ｃｍ ｆｏｒ ６０μｓ ｗａｓ ｔｈｅ ｂｅｓｔ． Ｏｎｅ ｏｒ ｄｏｕｂｌｅ activation ｗａｓ ｅｎｏｕｇｈ ｔｏ ａｃｔｉｖａｔｅ ｔｈｅ ｐｏｒｃｉｎｅ ｏｏｃｙｔｅｓ． Ｔｏｏ ｍｕｃｈ ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ activation ｍｉｇｈｔ ｈｕｒｔ ｔｈｅ ｏｏｃｙｔｅｓ． The combined application of electrical activation and chemical activation could improve the rate of cleavage of oocytes.

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： oｏｃｙｔｅｓ； iｎ ｖｉｔｒｏ ｃｕｌｔｕｒｅ； aｃｔｉｖａｔｉｏｎ； pｉｇｓ

在大多哺乳動(dòng)物中，排出的卵母細(xì)胞都停留在ＭⅡ期直至被精子受精激活或人工誘導(dǎo)激活才完成第二次成熟分裂。精子進(jìn)入ＭⅡ期，卵母細(xì)胞啟動(dòng)繼續(xù)發(fā)育的過程稱為卵母細(xì)胞激活。它包括一系列級(jí)聯(lián)發(fā)生形態(tài)和生理變化等激活事件。盡管細(xì)胞核移植技術(shù)的開展在牛、羊、小鼠、豬等動(dòng)物上獲得成功，但總效率仍很低，而豬的體細(xì)胞核移植效率更低，出生活仔數(shù)與移植胚的比率僅為１％左右［１－３］。……