采用真空泵法快速獲取豬卵母細胞

摘要：試驗比較了真空泵法與傳統的手動抽吸法對豬卵母細胞成熟效果的影響，結果表明，真空泵法在平均使用時間、卵母細胞的收集效率及Ａ、Ｂ級卵母細胞所占的比例方面均優于手動抽吸法，在卵母細胞的成熟率方面稍低于手動抽吸法。表明真空泵法是一種有效的豬卵母細胞采集方法。

關鍵詞：豬卵母細胞；體外成熟；真空泵法；手動抽吸法

中圖分類號：Ｑ８１３．７；Ｓ８２８．３文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）21－4438-03

Ｒａｐｉｄ Ｃｏｌｌｅｃｔｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｗｉｎｅ Ｏｏｃｙｔｅｓ ｂｙ Ｖａｃｕｕｍ Ｐｕｍｐ

ＸＩＡＯ Ｈｏｎｇ－ｗｅｉ，ＺＨＥＮＧ Ｘｉｎ－ｍｉｎ，ＬＩＵ Ｘｉ－ｍｅｉ，ＱＩＡＯ Ｘｉａｎ－ｆｅｎｇ，ＬＩ Ｌｉ，ＺＨＡＮＧ Ｌｉ－ｐｉｎｇ，ＨＵＡ Ｗｅｎ－ｊｕｎ，

ＢＩ Ｙａｎ－ｚｈｅｎ，ＨＵＡ Ｚａｉ－ｄｏｎｇ，ＺＨＯＵ Ｊｉｎg－ｒｏｎｇ

（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ husbandry ａｎｄ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ， Ｈｕｂｅｉ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅs ／ Ｈｕｂｅｉ Ｋｅｙ Ｌａｂoratory ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｅｍｂｒｙｏ Engineering ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ，Ｗｕｈａｎ ４３００６４， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｉｓ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｗａｓ ａｉｍｅｄ ｔｏ ｓｅｔ ｕｐ ａ ｎｅｗ ｓｗｉｎｅ ｏｏｃｙｔｅｓ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｗｉｔｈ ｖａｃｕｕｍ ｐｕｍｐ ｔｏ substitute for ｔｈｅ ｏｌｄ ｍａｎｕａｌ ａｓｐｉｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒａｉｓｅ ｔｈｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｔｈｅ ｓｗｉｎｅ ｏｏｃｙｔｅｓ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｖａｃｕｕｍ ｐｕｍｐ ｗａｓ ｓｕｐｅｒｉｏｒ ｔｏ ｍａｎｕａｌ ａｓｐｉｒａｔｉｏｎ ａｔ ａｖｅｒａｇｅ ｕｓａｇｅ ｔｉｍｅ， ｔｈｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｔｈｅ ｏｏｃｙｔｅｓ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｒａｔｅ ｏｆ A，B ｑｕａｌｉｔｙ ｏｏｃｙｔｅｓ， ｂｕｔ ｉｎｆｅｒｉｏｒ ａｔ ｔｈｅ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒｅ． Ｉｔ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ of ｏｏｃｙｔｅ ｗｉｔｈ ｖａｃｕｕｍ ｐｕｍｐ ｗａｓ ａ ｎｅｗ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｍｅｔｈｏｄ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｓｗｉｎｅ ｏｏｃｙｔｅｓ； ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ； collection method ｗｉｔｈ ｖａｃｃｕｍ ｐｕｍｐ； manual aspiration method

自１９８９年Ｍａｔｔｉｏｌｉａ等［１］用體外成熟的卵母細胞獲得試管豬以來，卵母細胞的體外成熟培養已經取得了較大的進展［２］。而從屠宰場廢棄卵巢中抽取卵母細胞已為大多研究者所接受。但對于優良的種畜禽、珍稀野生動物以及人而言，通常所用的抽吸法會浪費掉許多小卵泡內的卵母細胞，對卵母細胞上卵丘細胞的完整性也有一定的影響。因此，如何進一步提高卵母細胞的采集效率，為胚胎工程技術準備更多優良的成熟卵母細胞就成為了研究者所關注的焦點［３，４］。

傳統的豬卵母細胞的獲取方法有剝離法、刺破法、刀片切割法、注射器抽吸法（以下簡稱抽吸法）等。現有的收集母畜卵母細胞的具體操作中，剝離法、刺破法、刀片切割法這三種方法操作繁瑣，耗時長，獲得的卵母細胞少。而采集者在使用注射器抽吸法時常用一只手握卵巢，另一只手拿注射器，采用注射器產生的負壓采集卵巢表面的卵泡，使卵母細胞和卵泡液一起采集到注射器中，再把采集得到的混合物從注射器中注入撿卵皿中，作業步驟多，耗時也多。為了克服現有采集法每次取卵的作業步驟多、耗時長的不足，本試驗用機械抽吸法（以下簡稱真空泵法）代替傳統的手工操作，借此提高豬卵母細胞的采集效率，為豬胚胎工程提供更多的試驗材料。

１材料與方法

１．１主要儀器設備

ＣＯ２培養箱、倒置顯微鏡、恒溫水浴鍋、Φ３５ ｍｍ培養皿、電機、玻璃瓶、橡膠管、針頭等。

１．２豬卵巢的采集與豬卵母細胞的獲得

本試驗所用豬卵巢采自武漢某屠宰場，挑選剛剛屠宰的直徑１．０～２．５ ｃｍ、卵泡顏色清亮、形態正常（無過大、無病變卵泡）的豬卵巢剪下，放入加有雙抗的３５～３８ ℃的滅菌生理鹽水中，在２ ｈ內送回實驗室。隨后用等溫生理鹽水沖洗２～３次至無血水。剪去卵巢上附帶的輸卵管和系膜，用滅菌吸水紙吸干備用。

１．２．１抽吸法獲取豬卵母細胞在用注射器抽吸法時，采集者用一只手握豬卵巢，另一只手拿注射器，采用注射器產生的負壓采集豬卵巢表面的直徑在３～６ ｍｍ的卵泡，使豬卵母細胞和卵泡液一起采集到注射器中，再把采集到的混合物從注射器中注入到撿卵皿中。

１．２．２真空泵法獲取豬卵母細胞按孫健等［５］的方法準備真空泵及其附屬裝備，并調整好負壓。用１６號針頭抽取豬卵巢上直徑３～６ ｍｍ的卵泡。

待所有樣品處理完畢后，顯微鏡下挑取顆粒細胞包裹完整、胞質均勻的卵丘卵母細胞復合體（Ｃｕｍｕｌｕｓ－ｏｏｃｙｔｅ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ，ＣＯＣｓ），將挑選的ＣＯＣｓ放入成熟液中培養４４～４６ ｈ，培養條件為３９ ℃，５％ＣＯ２，飽和濕度。

１．３卵丘－卵母細胞復合體的分級

根據卵母細胞外卵丘細胞的有無和數量，將卵母細胞分為四級：Ａ級卵丘－卵母細胞復合體（卵丘細胞致密，至少有５層卵丘細胞完全包裹卵母細胞），Ｂ級卵丘－卵母細胞復合體（卵丘細胞為２～４層，基本上包裹卵母細胞），Ｃ級卵丘－卵母細胞復合體（卵丘細胞出現破損，只有部分為卵丘細胞包被），Ｄ級為裸卵。為比較不同采集方法對培養效果的影響，本試驗選擇Ａ、Ｂ級以及一般不用來培養的Ｃ級卵丘－卵母細胞復合體培養。

１．４體外成熟培養

卵母細胞的培養采用四孔板培養法：每孔４００ μＬ的培養體系內放入５０～６０枚卵，在５％ ＣＯ２、９５％空氣、３８．５ ℃飽和濕度下培養４４～４６ ｈ。

１．５卵母細胞的成熟鑒定

卵母細胞成熟培養４４ ｈ后，用吸卵管吸取卵母細胞，轉入含有０．１％透明質酸酶溶液中，于培養箱中孵育５ ｍｉｎ，用吸卵管反復吹打卵母細胞，除去其周圍的顆粒細胞，在倒置顯微鏡下觀察，以第一極體排出作為卵母細胞成熟的標志。

１．６試驗設計

本試驗旨在比較抽吸法和真空泵法對豬卵母細胞收集效率和成熟率的影響。試驗分為２組，即抽吸法組和真空泵法組，比較兩種抽吸方法在時間、可用卵母細胞的獲得效率及成熟率等方面的差異。

１．７統計分析

所得數據經ＳＰＳＳ統計軟件進行ｔ檢驗。

２結果

應用抽吸法和真空泵法采集卵母細胞按Ａ、Ｂ、Ｃ三級分類，記錄各ＣＯＣ數與時間（表１）。表１結果顯示，采用真空泵法在平均使用時間、卵母細胞的收集效率及Ａ、Ｂ級卵母細胞所占的比例方面均優于抽吸法，而抽吸法則在Ｃ級卵母細胞數量和卵母細胞的成熟率方面占優勢。真空泵法所得的卵母細胞數顯著高于抽吸法（Ｐ＜０．０５），所用的時間也顯著低于抽吸法（Ｐ＜０．０５）。

３小結與討論

因卵母細胞的采集方法不同而會影響到卵母細胞的采集數、采集效率和卵丘細胞的完整程度。隨著胚胎工程技術的發展，研究者越來越期望能夠有較多的卵母細胞可以進行研究，同時也考慮到采集的效率和卵丘細胞的完整性，采集的效率決定了卵母細胞在給定溫度和高氧環境下滯留時間的長短，卵丘細胞的完整性決定了對卵母細胞所需營養的輸送并標志著卵母細胞自身的生長發育階段。本試驗采用真空泵法、抽吸法獲取卵母細胞，在采集效率、卵母細胞數／卵巢、Ａ（Ｂ）級卵母細胞的獲得方面，采用真空泵法得到的結果都好于抽吸法。究其原因，發現在手動抽吸操作過程中實驗者只抽吸卵巢表面的可見卵泡，而母畜卵巢中的一個發生波中募集的卵泡數遠大于可見卵泡數，還有許多卵泡隱藏于卵巢內部及皮質層內不易看到，而采用真空泵法時，卵母細胞除了來自于卵巢表面的可見卵泡外，還有一部分卵母細胞來自于卵巢內部或皮質層中。實驗者在使用抽吸法時，在針口的壓力主要是間斷性的負壓，而真空泵法在針口的壓力是持續性的壓力。在采用真空泵法時，除了穿刺可見卵泡外，還在卵巢皮質上盲穿，這樣可以盡可能獲得更多的卵母細胞。所以兩者相比較，真空泵法所得到的卵母細胞數要明顯多于抽吸法。

從統計數據可以看出，采用真空泵法獲得的Ｃ級卵母細胞數要多于手動抽吸法，這是由于在真空泵抽吸過程中，由于盲刺導致吸入部分閉鎖卵母細胞或大卵泡中的過熟卵母細胞，但Ａ、Ｂ級卵母細胞數量上的優勢彌補了由于上述原因造成的Ｃ級卵母細胞較多的缺點。

在豬卵母細胞培養后的成熟率方面，抽吸法高于真空泵法（分別為６４．２１％和６２．３１％），究其原因，可能是由于真空泵法吸入了部分小腔卵泡卵母細胞。這與前人報道的從直徑２ ｍｍ以下的卵泡中獲得的卵母細胞其成熟率和卵裂率明顯低于大卵泡中得到的卵母細胞［６］相一致。目前，關于小腔卵母細胞體外培養的研究較少，所得到的成熟培養試驗結果差別也較大，盧晟盛等［７］僅得到了１１％～１２％的成熟率，而鄭培棟等［８］得到了２１．２６％的成熟率，Ｓｍｅｄｔ等［９］在山羊小腔卵母細胞的研究中得到了２９．４５％的成熟率，但與大腔卵泡卵母細胞相比，其成熟率還是較低。這可能是導致真空泵法得到的卵母細胞成熟率稍低的原因。此外，也有可能是不當的抽吸力造成的沖擊對卵母細胞胞質內部造成了損傷而造成卵母細胞成熟率稍低。

對于卵母細胞的成熟標志，不同的研究者所持的觀點不盡相同。梁冠生等［１０］在１９９１年就指出卵丘細胞的擴散不能準確地反映出卵母細胞的成熟情況。Ｌｅｉｂｆｒｉｅｄ等［１１］于１９８３年也研究發現第一極體的釋放并不是卵母細胞成熟的惟一標志。本試驗中以兩個標準［１２］對豬卵母細胞的成熟做了判定，發現抽吸法的成熟率比真空泵法稍高。

綜上所述，真空泵法在平均使用時間、卵母細胞的收集效率及Ａ、Ｂ級卵母細胞所占的比例方面均優于手動抽吸法，在卵母細胞的成熟率方面稍低于抽吸法，是一種有效的豬卵母細胞采集方法，可以代替目前的抽吸法。

參考文獻：

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［１１］ ＬＥＩＢＦＲＩＥＤ Ｍ Ｌ，ＢＡＶＩＳＴＥＲ Ｂ Ｄ． Ｆｅｒｔｉｌｉｚａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍａｔｕｒｅｄ ｏｏｃｙｔｅｓ ｆｒｏｍ ｇｏｌｄｅｎ ｈａｍｓｔｅｒ［Ｊ］． Ｊ Ｅｘｐ Ｚｏｏｌ，１９８３，２２（６）：４８１－４８５．

［１２］ 姜國誠，秦鵬春．豬卵母細胞的室溫（２０ ℃）保存與成熟培養［Ｊ］．畜牧獸醫學報，１９９２，２３（４）：２９５－２９８．