提取方法與部位對浙貝母基因組DNA提取質量的影響

摘要：探討了改良ＣＴＡＢ法、ＳＤＳ法、高鹽低ｐＨ法和試劑盒法對浙貝母（Ｆｒｉｔｉｌｌａｒｉａ ｔｈｕｎｂｅｒｇｉｉ Ｍｉｑ．）基因組ＤＮＡ的提取效果。綜合比較了各方法提取的ＤＮＡ濃度、純度、完整性，結果表明高鹽低ｐＨ法是比較適合浙貝母新鮮葉片基因組ＤＮＡ提取的方法。比較了分別以葉片和鱗莖為材料提取的ＤＮＡ質量，發現以新鮮葉片為材料提取的ＤＮＡ濃度和純度較高，更適合用于提取浙貝母基因組ＤＮＡ。

關鍵詞：浙貝母（Ｆｒｉｔｉｌｌａｒｉａ ｔｈｕｎｂｅｒｇｉｉ Ｍｉｑ．）；基因組ＤＮＡ；提取

中圖分類號：Ｓ５６７．２３＋１文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）21－4503-03

Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅｓ ｏｎ ｔｈｅ Ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ

ｉｎ Ｆｒｉｔｉｌｌａｒｉａ ｔｈｕｎｂｅｒｇｉｉ

ＺＨＯＵ Ｊｉｅ１，ＷＡＮＧ Ｘｉａｏ－ｆｅｉ２，ＪＩＮ Ｘｉａｏ－ｘｉａ２，ＷＡＮＧ Ｚｈｏｎｇ－ｈｕａ２

（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｓｃｉ－tｅｃｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｈａｎｇｚｈｏｕ ３１００１８，Ｃｈｉｎａ；

２．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｗａｎｌｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｎｉｎｇｂｏ ３１５１００， Zhejiang，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＣＴＡＢ ｍｅｔｈｏｄ， ｈｉｇｈ ｓａｌｔ ｌｏｗ ｐＨ ｍｅｔｈｏｄ， ＳＤＳ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ－ｐｒｅｐ ｋｉｔ ｍｅｔｈｏｄ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｅｘｔｒａｃｔ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｆｒｏｍ Ｆｒｉｔｉｌｌａｒｉａ ｔｈｕｎｂｅｒｇｉｉ Ｍｉｑ． Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ， ｐｕｒｉｔｙ ａｎｄ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ ｏｆ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｂｙ ｖａｒｉｏｕｓ ｍｅｔｈｏｄｓ showed ｔｈａｔ ｈｉｇｈ ｓａｌｔ ｌｏｗ ｐＨ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｔｈｅ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ＤＮＡ ｆｒｏｍ Ｆ． ｔｈｕｎｂｅｒｇｉｉ． Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｆｒｅｓｈ ｌｅａｖｅｓ ａｎｄ ｂｕｌｂ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｔｈａｔ ＤＮＡ ｏｂｔａｉｎed ｆｒｏｍ ｆｒｅｓｈ ｌｅａｖｅｓ ｗａｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈｅｒ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｔｙ， ｔｈｕｓ ｆｒｅｓｈ ｌｅａｖｅｓ ｗｅｒｅ ｂｅｔｔｅｒ ｍａｔｅｒｉａｌs ｆｏｒ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｆ． ｔｈｕｎｂｅｒｇｉｉ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｆｒｉｔｉｌｌａｒｉａ ｔｈｕｎｂｅｒｇｉｉ Ｍｉｑ．； ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ； ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ

浙貝母（Ｆｒｉｔｉｌｌａｒｉａ ｔｈｕｎｂｅｒｇｉｉ Ｍｉｑ．）是百合科貝母屬的多年生草本植物，又名象貝、大貝、珠貝、土貝、元寶貝、蘇貝。浙貝母的鱗莖干燥，性苦、寒，具有清熱散結、化痰止咳、開郁之功效，是較為常用的中藥材，也是著名的“浙八味”之一［１］。ＤＮＡ的提取是進行各種分子生物學實驗的基礎，提取的ＤＮＡ濃度和質量對后續實驗結果有較大的影響。而中藥材中含有豐富的次生代謝產物，使其ＤＮＡ提取較為困難，有頑拗植物之稱［２］。本研究比較了用不同方法從中藥材浙貝母的新鮮葉片和鱗莖中提取基因組ＤＮＡ的效果，從中找出簡單高效的方法，以為開展浙貝母種質資源的遺傳多樣性分析及其分子鑒定奠定基礎。

１材料和方法

１．１材料

材料采集地點為浙江省寧波市鄞州區章水鎮，２０１０年３月２０日采集寬葉浙貝母、狹葉浙貝母、多子浙貝母三個品種的新鮮嫩葉，２０１０年１０月５日采集多子浙貝母的鱗莖用于實驗。

１．２方法

１．２．１材料的預處理

１）葉片：將新鮮葉片洗凈擦干后剪碎，放入預冷的研缽中，加入適量的ＰＶＰ提取液以及２％的β－巰基乙醇進行快速研磨。研磨成均勻的糊狀后取適量分裝入１．５ ｍＬ的離心管中，待用。

２）鱗莖：①將鱗莖去皮洗凈后切成細小的狀塊（冰上進行），放入預冷的研缽中，加入適量的ＰＶＰ提取液以及２％的β－巰基乙醇進行快速研磨。研磨成均勻的糊狀后取適量分裝入１．５ ｍＬ的離心管中，待用；②將鱗莖去皮洗凈后烘干，用萬能粉碎機研磨成細粉狀，稱取適量到離心管中，待用。

１．２．２基因組ＤＮＡ提取以多子浙貝母葉片為材料，考察ＣＴＡＢ法、高鹽低ｐＨ法、ＳＤＳ法和試劑盒法對浙貝母基因組ＤＮＡ的提取效果；并考察高鹽低ｐＨ法對不同浙貝母品種（狹葉、寬葉和多子浙貝母）和部位（多子浙貝母的新鮮葉片、新鮮鱗莖、干燥鱗莖粉末）基因組ＤＮＡ的提取效果。各ＤＮＡ提取方法如下：

１）ＣＴＡＢ提取法［３，４］：①向裝有浙貝母材料的離心管中加入８００ μＬ預熱的ＣＴＡＢ提取緩沖液，混勻后６５ ℃水浴１ ｈ，１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１５ ｍｉｎ；②取上清，加入等體積的氯仿／異戊醇（體積比為２４∶１，下同）輕輕混勻，１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１５ ｍｉｎ，重復此步驟一次；③取上清，加入２／３體積的異丙醇，放入

－２０ ℃冰箱４０ ｍｉｎ以沉淀ＤＮＡ；④加入２００ μＬ ７０％乙醇洗滌ＤＮＡ ２～３次；⑤將離心管倒置于通風柜里，使ＤＮＡ盡量干燥；⑥加入２０ μＬ ＴＥ溶解ＤＮＡ，４ ℃保存備用。

２）高鹽低ｐＨ法：①向裝有浙貝母材料的離心管中加入８００ μＬ預熱的提取緩沖液（１００ ｍｍｏｌ／Ｌ醋酸鈉，５０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ，５００ ｍｍｏｌ／Ｌ氯化鈉，質量分數２．５％的ＰＶＰ，質量分數３％的ＳＤＳ，ｐＨ ５．５），５６ ℃水浴３０ ｍｉｎ；②１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ，取上清加入２／３體積的２．５ ｍｏｌ／Ｌ醋酸鉀溶液，４ ℃放置１５ ｍｉｎ；③１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ，取上清，加入等體積的氯仿／異戊醇輕輕混勻，１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ，沉淀、洗滌、干燥和溶解步驟同ＣＴＡＢ法。

３）ＳＤＳ法：①向裝有浙貝母材料的離心管中加入８００ μＬ預熱的ＳＤＳ提取緩沖液，混勻后６５ ℃水浴１ ｈ，１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１５ ｍｉｎ；②取上清，加入等體積的氯仿／異戊醇輕輕混勻，１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１５ ｍｉｎ，重復此步驟一次；沉淀、洗滌、干燥和溶解步驟同ＣＴＡＢ法。

４）試劑盒法：采用上海生工生物工程技術服務有限公司的ＵＮＩＱ－１０柱式植物基因組抽提試劑盒。抽提步驟參考試劑盒說明書進行。

１．２．３ＤＮＡ純度和濃度檢測取稀釋３０倍的ＤＮＡ樣品３ μＬ，采用０．８％瓊脂糖凝膠電泳，經ＥＢ染色后成像分析。采用紫外分光光度法定量檢測ＤＮＡ的濃度與純度［５］，每個樣本重復3次取平均值。

１．２．４ＰＣＲ擴增及產物分析以高鹽低ｐＨ法提取的浙貝母基因組ＤＮＡ為模板，進行非特異性ＰＣＲ擴增。引物為上海生工生物工程技術服務有限公司生產的隨機引物Ｓ３１７，目標產物在２ ０００ ｂｐ以下，反應體系為２０ μＬ，包括ｄｄＨ２Ｏ １４．７ μＬ，１０×ＰＣＲ緩沖液（加Ｍｇ２＋）２ μＬ，ｄＮＴＰｓ １．６ μＬ，引物０．６ μＬ，ＤＮＡ模板０．８ μＬ（１００ ｎｇ／μＬ），Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶０．３ Ｕ（ＴａＫａＲａ公司生產）。反應程序為：９４ ℃預變性４ ｍｉｎ；９４ ℃變性４５ ｓ，３７ ℃退火６０ ｓ，７２ ℃延伸２ ｍｉｎ，循環３５次；７２ ℃延伸１０ ｍｉｎ，４ ℃保溫［６］。取３ μＬ ＰＣＲ產物，采用１．５％的瓊脂糖凝膠電泳進行分析，經ＥＢ染色后成像分析。

２結果與分析

２．１不同方法對浙貝母基因組ＤＮＡ的提取效果

ＣＴＡＢ法和ＳＤＳ法提取得到的ＤＮＡ濃度高于高鹽低ｐＨ法和試劑盒法得到的ＤＮＡ濃度，瓊脂糖凝膠電泳的條帶也更亮，但存在拖帶，ＣＴＡＢ法提取的ＤＮＡ ＯＤ２６０ ｎｍ／２８０ ｎｍ大于２，可能含有較多的ＲＮＡ，要提高提取效果，應加入適量的ＲＮａｓｅ；ＳＤＳ法提取的ＤＮＡ ＯＤ２６０ ｎｍ／２８０ ｎｍ偏小，可能是含有蛋白和糖。高鹽低ｐＨ法和試劑盒法提取的ＤＮＡ濃度相對較低，但條帶清晰，紫外分光光度法檢測顯示ＯＤ２６０ ｎｍ／２８０ ｎｍ在１．８～１．９范圍內，純度較高（表１，圖１）。

２．２高鹽低ｐＨ法對不同浙貝母品種基因組ＤＮＡ的提取效果

高鹽低ｐＨ法提取的不同品種浙貝母的基因組ＤＮＡ的ＯＤ２６０ ｎｍ／２８０ ｎｍ在１．８５～１．９１之間，濃度在１２ μｇ／ｍＬ左右（稀釋３０倍），瓊脂糖凝膠電泳條帶清晰，亮度均一，可見高鹽低ｐＨ法可用于提取不同品種的浙貝母基因組ＤＮＡ（表２，圖２）。

２．３高鹽低ｐＨ法對浙貝母不同組織部位基因組ＤＮＡ的提取效果

以浙貝母葉片為材料，提取的ＤＮＡ條帶清晰，亮度均一；從鱗莖干燥粉末提取的ＤＮＡ條帶亮，但雜質多，拖尾嚴重，用新鮮鱗莖作為實驗材料未提取出ＤＮＡ（圖３），這可能是由于鱗莖中富含多糖類等儲藏性成分，大大增加了提取ＤＮＡ的難度，而預處理的過程中切碎或者烘干、研磨又造成了ＤＮＡ的降解。可見，新鮮葉片更適合作為浙貝母基因組ＤＮＡ提取和分子生物學研究的材料。

２．４ＰＣＲ擴增

以高鹽低ｐＨ法提取的浙貝母葉片基因組ＤＮＡ為模板進行非特異性ＰＣＲ擴增，擴增條帶較清晰（圖４），這說明該方法提取的浙貝母基因組ＤＮＡ質量較好，能滿足浙貝母分子生物學研究的需要。

３結論與討論

以浙貝母的新鮮葉片為實驗材料，高鹽低ｐＨ法和試劑盒法均能提取到純度高且完整性較好的浙貝母基因組ＤＮＡ，但從經濟角度來講，高鹽低ｐＨ法優于試劑盒法。藥用植物一般都含有各種復雜的次生代謝產物，一些小分子次生代謝產物如有機酸、黃酮、萜類等含有酚羥基的化合物，氧化后易和ＤＮＡ結合，從而使ＤＮＡ降解或者會抑制酶的活性，此外多糖類物質也會影響浙貝母基因組ＤＮＡ的提取，所以以鱗莖為材料提取效果很差。另外在樣品研磨的過程中，研磨時間和研磨程度都可能會導致ＤＮＡ的降解，從而影響基因組ＤＮＡ的純度和完整性。

基因組ＤＮＡ的提取質量不僅與方法、組織等有關，還與提取條件密切相關。因此，提取條件的探索和優化是非常必要的。如β－巰基乙醇的濃度、提取緩沖液的最適ｐＨ、水浴時間、溫度、離心時間和速度及提取緩沖液與樣本容量之間的相互關系等［７］，這些具體條件的優化有待于進一步研究與探索。

參考文獻：

［１］汪發瓚，唐進，陳心啟，等． 中國植物志：第１４卷［Ｍ］． 北京： 科學出版社，１９８８．

［２］ 段中崗，黃瓊林，楊錦芬，等． 適合中藥材ＤＮＡ條形碼分析的ＤＮＡ提取方法的研究［Ｊ］． 中藥新藥與臨床藥理，２００９，２０（５）：４８０－４８４．

［３］ ＤＥＬＬＡＰＯＲＴＡ Ｓ Ｌ，ＷＯＯＤ Ｊ，ＨＩＣＫＳ Ｊ Ｂ． Ａ ｐｌａｎｔ ＤＮＡ ｍｉｎｉｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ：Ｖｅｒｓｉｏｎ ＩＩ［Ｊ］． Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ，１９８３，１（４）： １９－２１．

［４］ ＳＡＧＨＡＩ－ＭＡＲＯＯＦ Ｍ Ａ，ＳＯＬＩＭＡＮ Ｋ Ｍ，ＪＯＲＧＥＮＳＥＮ Ｒ Ａ， ｅｔ ａｌ． Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＤＮＡ ｓｐａｃｅｒ－ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ｉｎ ｂａｒｌｅｙ： Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ， ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｌｏｃａｔｉｏｎ， ａｎｄ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｄｙｎａｍｉｃｓ［Ｊ］． Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９８４，８１（２４）：８０１４－８０１８．

［５］ 梁宋平． 生物化學與分子生物學實驗教程［Ｍ］． 北京：高等教育出版社，２００３．１６.

［６］ 陸含，朱世華，周書軍，等． 浙貝母４品種及５種貝母遺傳多樣性的ＲＡＰＤ分析［Ｊ］． 寧波大學學報（理工版），２００９，１１（１）：４４－４７．

［７］ 郭寶林，劉萬水，黃文華，等． 影響總ＤＮＡ提取因素的探討［Ｊ］． 中國中藥雜志，２００６，３１（１１）：９２４－９２６．