交聯透明質酸鈉凝膠的制備工藝研究

王艷果，傅經國，郭利兵

（河南科學院化學研究所，河南 鄭州450002）

交聯透明質酸鈉凝膠的制備工藝研究

王艷果，傅經國，郭利兵

（河南科學院化學研究所，河南 鄭州450002）

以細菌發酵透明質酸（HA）為原料，在室溫條件下采用二乙烯基砜（DVS）交聯劑制備DVS-HA凝膠，為去除未反應的交聯劑進行多方案實驗，通過氣相色譜法檢測凝膠中殘留交聯劑含量，以期獲得較優工藝方案，為進一步開發HA臨床應用產品奠定了基礎。

交聯透明質酸鈉;二乙烯基砜;氣相色譜法

透明質酸（hyaluronic acid HA）是一種從動物組織提取的天然陽離子多聚糖，是由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖交替排列構成的長鏈高分子，具有良好的親水性、黏彈性、潤滑性。但在臨床醫學中發現天然HA易被生物降解，硬度和力學強度不夠大，限制了HA的應用[1]。將天然HA進行交聯可得更大交聯網狀結構的衍生物，其化學和力學性能比HA更穩定且具有生物相容性和生物降解性，對人體無毒、無刺激作用，大大拓寬了HA的臨床應用領域，尤其是獲得新型醫用生物材料方面，如防術后粘連材料、軟組織填充材料、新型藥物緩釋基質、美容和整形填充物等[2]。

使用二乙烯基砜（DVS）作為交聯劑制備HA衍生物是眾多制備交聯HA的方法之一。早在20世紀80年代，Balazs成功制備得到了交聯HA凝膠。但是，DVS-HA凝膠中可能殘留有交聯劑DVS，而DVS是對機體有害的物質，是引起臨床不良反應的主要成分，不利于應用于生物體內，所以必須對其進行去除[3~4]。本文通過不同實驗方案去除交聯劑DVS，對其工藝技術進行探討研究，作為開發HA臨床應用產品的基礎。

1 實驗部分

1．1 儀器和試劑

Angilent7890A GC，0．22μm 針頭過濾器，電子天平，98-1型磁力攪拌器。發酵法生產的透明質酸鈉（HA，醫用輔料級），二乙烯基砜（含量99%）;乙醇、磷酸二氫鉀和磷酸氫二鈉均為分析純。

1．2 DVS-HA凝膠的合成

將透明質酸鈉 0．5g 溶解到 12．5mL 0．2mol·L－1NaOH溶液中獲得4%（w／v）的溶液，室溫攪拌1h，溶液均質透明。稱取一定量DVS加水稀釋至0．5mL，將其加入透明質酸堿溶液，迅速攪拌，室溫下反應1h得粘稠狀凝膠。反應式如下:

1．3 凝膠后處理

1．3．1 方案一

將凝膠在 80mL 磷酸鹽緩沖溶液（0．01mol·L－1，p H 7．0）中溶脹 48h，過濾除去緩沖溶液，用 40mL水洗滌2次，再用80mL等滲磷酸鹽緩沖溶液（0．01mol·L－1，pH7．0）浸泡至凝膠透明均質，過濾，水沖洗得透明質酸鈉水凝膠。

1．3．2 方案二

將凝膠在 80mL 磷酸鹽緩沖溶液（0．01mol·L－1，pH 7．0）中溶脹 24h，過濾除去緩沖溶液，用 40mL水洗滌2次，再用3倍體積95%乙醇洗滌凝膠變為絮狀沉淀，過濾后用磷酸鹽緩沖溶液洗滌3次，除去殘留乙醇，然后用80mL生理鹽水浸泡至凝膠透明均質，過濾得透明質酸鈉水凝膠。

1．3．3 方案三

將凝膠用 0．02mol·L－1鹽酸溶液洗滌至中性，再用3倍體積95%乙醇洗滌，凝膠變為絮狀沉淀，過濾，反復洗滌2~3次，取每次乙醇上清液，用0．22μm針頭過濾器過濾，取濾液進行氣相檢測，DVS殘留量合格后停止洗滌。過濾得白色絮狀沉淀，除去殘留乙醇，得交聯透明質酸干粉。稱取干粉質量按含量要求加入生理鹽水浸泡至透明均質得透明質酸鈉水凝膠。

1．3 氣相檢測

參照文獻[5]方法進行氣相色譜法檢測。稱取1g水凝膠，加入4mL乙醇，攪拌凝膠變為絮狀沉淀，取上清液，用0．22μm針頭過濾器過濾，取濾液裝入試劑瓶自動進樣進行檢測。按外標法以峰面積計算樣品中DVS殘留量。

2 結果與討論

由于交聯劑DVS在水和乙醇中具有很強的溶解能力，所以溶脹步驟既可以使凝膠的pH穩定也可以去除殘留的DVS。通過上述實驗可以看出:方案一比較簡單易行，但是需要長時間浸泡才能使凝膠中的DVS殘留量達到要求;根據HA以及DVS-HA在乙醇中不溶解的性質，方案二與三用乙醇沉淀法很容易去除殘留DVS，同時也需要去除乙醇，形成凝膠必須滿足乙醇殘留量要求（不大于 400μg·g－1），增加了檢測步驟，與方案一相比，步驟相對繁瑣一些;方案三與方案二比較，優點是形成干粉容易保存，同時也可以按含量要求進行浸泡。

通過多方案實驗，初步篩選方案一作為DVSHA凝膠制備的較優工藝，但是HA臨床應用產品的開發還需要兼顧考慮其他因素，如流動性和可注射性等。

[1] 楊好，熊文說，應國清，等．交聯透明質酸衍生物的制備與應用進展[J]．化工進展，2006，25（12）:1410-1414．

[2] 陳景華，林樅，顧其勝，等．制備透明質酸衍生物交聯劑的應用研究 [J]．中國修復重建外科雜志，2004，18（1）:70-73．

[3] 葛翠蘭，顧其勝．交聯透明質酸凝膠中交聯劑的HPLC測定[J]．上海生物醫學工程，2006， 27（4）:223-225．

[4] 陳拓成，陳麗夙．交聯透明質酸的制造方法[P]．CN 101724164A，2010-06-09．

[5] 朱彬，葛翠蘭，顧其勝．氣相色譜法檢測交聯透明質酸中交聯劑殘留量 [J]．生物醫學工程學進展，2008，29（1）:26-28．

Preparation Technology of Crosslinked Sodium Hyaluronate Gels

WANGYan-guo， FUJing-guo，PANGShi-yi
（Institute of Chemistry， Henan Academy of Sciences， Zhengzhou 450002）

The HA-gels were prepared with bacterial fermentation of hyaluronic acid（HA）and divinyl sulfone（DVS）．To remove unreacted cross linking agent， many experiments were programmed．The content of DVSin gels was determined by gas chromatography．The HA-gels could be prepared under optimal reaction conditions，which established foundation to develop cosmetic HA products．

crosslinked sodium hyaluronate; divinyl sulphone; gas chromatography

TQ 464.1

A

1671-9905（2011）09-0008-02

王艷果（1981-），女，碩士，研究方向為有機合成，E-mail:hxswyg＠126．com

2011-05-26