MicroRNA在骨代謝中的研究進展

謝福平(綜述)，陳 江(審校)

(1.福建醫科大學研究生院，福州350004;2.福建醫科大學附屬口腔醫院種植科，福州350002)

骨是由骨髓基質干細胞、成骨細胞、破骨細胞、骨細胞、細胞外基質、礦物質等構成。正常生理狀態下，骨是通過以上各種細胞新陳代謝維持在一個相對動態平衡狀態下，假若平衡狀態被打破，隨之而來的是骨病理狀態，如骨質疏松、石骨癥。因此，研究基礎病變對于疾病的了解及治療具有相當重要的意義。

近年來，microRNA(miRNA)逐漸被人們熟知，miRNA在細胞分化，生物發育及疾病發生發展過程中發揮巨大作用，越來越多的引起研究人員的關注［1］。現針對miRNA在骨代謝相關研究及其進展予以綜述。

1 miRNA概述

miRNA最先由Lee等［2］發現，是一種含有莖環結構的，非蛋白編碼的小RNA分子(21～23個核苷酸)，類似于小干擾RNA。miRNA基因類似于許多編碼蛋白基因，通常是在細胞核內由RNA聚合酶Ⅱ轉錄，最初產物為大的具有5'帽子結構和3'多聚腺苷酸尾的微小RNA前體(pri-miRNA)。Pri-miRNA在核酸酶Drosha和其輔助因子Pasha的作用下，5'帽子結構和3'多聚腺苷酸尾被剪切，變為約70個核苷酸組成的 pre-miRNA。RAN-GTP和轉運蛋白(exportin)將pre-miRNA輸送到細胞質中［3］。隨后，另一個核酸酶Dicer將其莖環結構剪切，產生約為22個核苷酸長度的miRNA:miRNA*雙鏈。Dicer將成熟的RNA雙鏈釋放后，很快被一組蛋白反應結合形成RNA-蛋白復合物，被稱為miRNA誘導沉默復合物。在miRNA誘導沉默復合物中，一條成熟的單鏈miRNA保留在這一復合體中，它能識別位于靶mRNA上3'端非編碼區的結合位點。加工成熟后miRNA通過和靶基因mRNA堿基配對引導沉默復合體降解mRNA或阻礙其翻譯，具有破壞目標特異性基因的轉錄產物或者誘導翻譯抑制的功能。

miRNA以及RNA-蛋白質復合物在動物［4］和植物［5］中廣泛表達。miRNAs只在特定的組織和發育階段表達，具有組織特異性和時序性，決定著組織和細胞的功能特異的調節過程中起重要作用［6］。

2 miRNA與骨形成相關細胞

干細胞是存在于生物體內具有強大的分化增殖潛能的細胞，對于機體生長發育、損傷后修復、新陳代謝等均具有重大的意義。成人的基質干細胞是一類未分化的多潛能細胞，主要位于骨髓中，能分化為成骨細胞、軟骨細胞、成纖維細胞、脂肪細胞等等。miRNA是細胞增殖分化中的重要調節分子，與干細胞的增殖分化具有極為密切的關系，不論是在動物胚胎期骨的形成階段，還是在骨骼生長發育期抑或是成熟期，均有著重要的影響。

2.1 miRNA與胚胎期骨的發生發育 為了解miRNA在動物胚胎發育期的作用，研究者構建了Dicer基因剔除的小鼠，因為所有miRNA的成熟需要Dicer的參與，所以所有miRNA形成缺陷，這些基因缺陷鼠出生時就有明顯的生長缺陷，沒有母乳喂養時即死去。其骨骼大小明顯比正常鼠小，尤其是軟骨的分化增殖所受影響最大，因此，miRNA在骨形成階段以及動物的生長發育都是必不可少的［7］。如果說Dicer基因缺失使得全體miRNA功能異常，引起動物生長發育異常是毫無疑問的，那么個別miRNA功能缺失會如何呢?Watanabe等［8］剔除 Dnm3os基因(轉錄 miR-199a、miR-199a* 、miR-214)，觀察到Dnm3os基因缺失的幼犬絕大多數死于出生后1個月內。而Dnm3os基因缺失小鼠顯示出許多骨骼異常癥狀，包括顱頜面發育不全、脊椎發育缺陷癥、骨質減少等。更為重要的是，miR-199a、miR-199a*、miR-214在胚胎期表達水平明顯下調。這表明，Dnm3os基因在哺乳動物骨骼正常生長過程中具有不可或缺的地位。同時也說明miRNA與胚胎期干細胞的分化及增殖關系密切。

在動物胚胎發育完成后，miRNA在干細胞行使分化功能時，依然起著至關重要的作用。Oskowitz等［9］研究發現，miRNA調節人骨髓多潛能干細胞分化及白血病抑制因子的表達;當向成骨細胞分化時，19種miRNA表達水平上調;向脂肪細胞分化時，20種miRNA表達水平上調;hsa-mir199a和hsa-mir346抑制白血病抑制因子的分泌。Bae等［10］比較干細胞和成纖維細胞miRNA表水平的差異，發現有20多種miRNA表達水平具有明顯差別。顯然，miRNA介導的干細胞分化是維持細胞的更新所必需的。

人的一生中，細胞總是在不斷分化、增殖、凋亡，周而復始的運作以達到維持細胞的動態平衡，骨組織當然也不能例外。近年來，由于miRNA研究的風靡，許多學者將干細胞的分化與miRNA之間的關系作為研究重點。

2.2 miRNA調節干細胞分化為成骨細胞 干細胞向成骨細胞分化通常是在runt相關轉錄因子2(runt-related transcription factor 2，RUNX2)調節下轉變為前成骨細胞，前成骨細胞又接著在RUNX2、OSX作用下分化為成骨細胞，而RUNX2又受Smad家族蛋白、DLX3/5調控［11］;同時，骨形成蛋白也能影響Smad家族蛋白表達而影響干細胞的分化。骨形成蛋白與受體結合，激活Smad家族蛋白，Wnt激活。活化的Wnt依次激活卷曲蛋白、脂蛋白受體相關蛋白、DSH、軸素，形成復合物。該復合物使Axin-glycogen synthase-3β-APC復合物不穩定，從而抑制β連環蛋白水解，β連環蛋白濃度升高，移入細胞核與T細胞因子/淋巴細胞因子增強因子結合，從而促進特定基因表達，干細胞、前成骨細胞增殖，最終導致成骨細胞生成增多，并抵抗成骨細胞的凋亡［12］。

有研究［13］發現miR-29b能直接下調組蛋白脫乙酰化酶、轉化生長因子β3、ⅡA型活化素A受體等蛋白生成量，這些蛋白作為成骨細胞分化抑制物，表達水平降低有利于促進成骨細胞分化。同時，miR-29b減少 COL1A1、COL5A3、COL4A2 3'端非編碼區序列活性，從而減少或抑制膠原的合成。當膠原蛋白分泌達到一個穩定期時，miR-29b濃度升高，抑制膠原蛋白的合成，促進骨質礦化，利于骨質生成。

miR-206在骨形成蛋白2干預成纖維細胞系(C2C12)細胞后，表達水平下降。同樣，在C2C12細胞中激活Smad1/4后亦表現為miR-206表達減少，而Pri-miR-206表達水平升高，這表明骨形成蛋白2是通過抑制Pri-miR-206轉變為成熟miR-206這一環節而實現干細胞分化調節功能［14］。

在細胞和動物實驗中，發現在骨形成蛋白2誘導的骨形成過程中，miR-2861［15］過表達增強骨形成蛋白2誘導的骨形成作用，反之，減少miR-2861的表達，骨形成蛋白2誘導骨形成作用被減弱。在小鼠體內沉默 miR-2861編碼基因，可以觀察到減少RUNX2表達，進而抑制骨形成，減少骨量，臨床實驗亦觀察到miR-2861缺失患者，出現原發性骨質疏松癥。

Schoolmeesters等［16］在研究人干細胞向成骨細胞分化時發現，miRNA-489、miRNA-27a表達水平下調，miRNA-148b表達水平上調。其中，miRNA-489、miRNA-27a靶向大量基因編碼的RNA，但是AHSG、PEX7RD為二者共同的靶點。AHSG和CHRD基因編碼骨形成蛋白信號蛋白抑制物;PEX7編碼過氧化物體病毒基質酶受體(骨形成過程中的關鍵酶)。

miR-141和miR-200a作為前成骨細胞分化相關miRNA，能明顯調節骨形成蛋白2誘導的前成骨細胞的分化，這種調節機制是通過抑制DLX5轉錄而實現的［17］。

綜上所述，凡是對干細胞分化為成骨細胞的信號通路中的信號蛋白具有調節作用的miRNA，對干細胞的分化均有調節作用。據文獻報道，has-miR-135b［18］、miR-204［19］、miR-26a［20］等許多 miRNA 都是通過信號通路中的信號蛋白調節，達到對干細胞分化為成骨細胞調節作用，因此在此不做贅述。

2.3 miRNA 調節軟骨細胞代謝 miR-199a*［21］明顯抑制早期軟骨形成，減少早期標志基因如軟骨寡聚基質蛋白、Ⅱ型膠原等表達，同時，miR-199 a*又能抑制Smad1/4介導的靶基因反式激活作用，這兩種抑制作用都同時指向軟骨生成被抑制。盡管如此，在試驗中又觀察到，miR-199a*隨著骨形成蛋白2誘導軟骨形成的過程，其表達水平逐漸上升，推測miR-199a*可能是軟骨形成和成熟階段所必需的調節器。

骨關節炎是一類嚴重關節性疾病，miRNA-140與骨關節炎有密切關系。Miyaki等［22］通過細胞實驗發現，骨關節炎患者的軟骨細胞miRNA-140表達水平明顯低于正常人軟骨細胞miRNA-140表達水平，并且白細胞介素1β能抑制miRNA-140的表達。這都說明在炎癥狀態下，miRNA-140表達水平受到影響，從而引發骨關節病。值得一提的是，Jones等［23］研究發現骨關節炎患者與正常人軟骨細胞中多種miRNA表達水平具有明顯差異。比較突出的是miR-9、miR-98、miR146。miR-9 和 miR-98 過表達或者miR-146表達減少，減少了白細胞介素1β誘導的腫瘤壞死因子α產出量。上述研究結果有所不同，但是它們共同表明miRNA的變化導致了骨關節炎的發生。因此，miRNA與骨關節炎的關系密切。

2.4 miRNA與破骨細胞 破骨細胞前體分化過程中，DGCR8、Dicer1、Ago2基因在miRNA生物合成起重要作用，沉默 DGCR8、Dicer、Ago2基因后，全面抑制破骨細胞轉錄因子表達，減少破骨細胞形成，減少骨吸收。miR-223、NFI-A、巨噬細胞集落刺激因子受體與破骨細胞形成和分化有關，其中，巨噬細胞集落刺激因子受體是破骨細胞分化功能中的重要因子。因此，miR-223通過調節NFI-A和巨噬細胞集落刺激因子受體水平，而達到對破骨細胞的分化進行調節［24］。

3 小結

miRNA是生物生命過程中的重要調節分子，所以研究miRNA與骨疾病特別是miRNA與骨質疏松癥的關系，對口腔種植的發展具有重要的意義。隨著對miRNA作用機制的深入研究，人們對高等真核生物基因表達調控的了解將會達到更高的水平。這也將使miRNA可能成為疾病診斷的新的生物學標記，還可能使得這一分子成為藥靶，或是模擬這一分子進行新藥研發，這將可能會給人類疾病的治療提供一種新的手段。

［1］趙爽，劉默芳.MicroRNA作用機制研究的新進展［J］.中國科學 C 輯:生命科學，2009，39(1):109-113.

［2］Lee RC，Feinbaum RL，Ambros V.The C.Elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs withantisense complementarity to lin-14［J］.Cell，1993，75(5):843-854.

［3］Yi R，Qin Y，Macara IG，et al.Exportin-5 mediates the nuclear export of pre-microRNAs and short hairpin RNAs［J］.Genes Dev，2003，17(24):3011-3016.

［4］Zhang L，Chia JM，Kumari S，et al.A genome-wide characterization of microRNA genes in maize［J］.PLoS Genet，2009，5(11):e1000716.

［5］Lim LP，Glasner ME，Yekta S，et al.Vertebrate microRNA genes［J］.Science，2003，299(5612):1540.

［6］John B，Enright AJ，Aravin A，et al.Human microRNA targets［J］.PLoS Biol，2004，2(11):e363.

［7］Kobayashi T，Lu J，Cobb BS，et al.Dicer-dependent pathways regulate chondrocyte proliferation and differentiation［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2008，105(6):1949-1954.

［8］Watanabe T，Sato T，Amano T，et al.Dnm3os，a non-coding RNA，is required for normal growth and skeletal development in mice［J］.Dev Dyn，2008，237(12):3738-3748.

［9］Oskowitz AZ，Lu J，Penfornis P，et al.Human multipotent stromal cells from bone marrow and microRNA:regulation of differentiation and leukemia inhibitory factor expression［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2008，105(47):18372-18377.

［10］Bae S，Ahn JH，Park CW，et al.Gene and microRNA expression signatures of human mesenchymal stromal cells in comparison to fibroblasts［J］.Cell Tissue Res，2009，335(3):565-573.

［11］Mizuno Y，Tokuzawa Y，Ninomiya Y，et al.miR-210 promotes osteoblastic differentiation through inhibition of AcvR1b［J］.FEBS Lett，2009，583(13):2263-2268.

［12］Sun S.Bone disease drug discovery:examining the interactions between osteoblast and osteoclast［J］.Expert Opin Ther Targets，2008，12(2):239-251.

［13］Li Z，Hassan MQ，Jafferji M，et al.Biological functions of miR-29b contribute to positive regulation of osteoblast differentiation［J］.J Biol Chem，2009，284(23):15676-15684.

［14］Sato MM，Nashimoto M，Katagiri T，et al.Bone morphogenetic protein-2 down-regulates miR-206 expression by blocking its maturation process［J］.Biochem Biophys Res Commun，2009，383(1):125-129.

［15］Li H，Xie H，Liu W，et al.A novel microRNA targeting HDAC5 regulates osteoblast differentiation in mice and contributes to primary osteoporosis in humans［J］.J Clin Invest，2009，119(12):3666-3677.

［16］Schoolmeesters A，Eklund T，Leake D，et al.Functional profiling reveals critical role for zmiRNA in differentiation of human mesenchymal stem cells［J］.PLoS One，2009，4(5):e5605.

［17］Itoh T，Nozawa Y，Akao Y.MicroRNA-141 and-200a are involved in bone morphogenetic protein-2-induced mouse pre-osteoblast differentiation by targeting distal-less homeobox 5［J］.J Biol Chem，2009，284(29):19272-19279.

［18］Schaap-Oziemlak A，Raymakers RA，Bergevoet SM，et al.MicroRNA hsa-miR-135b regulates mineralization in osteogenic differentiation of human Unrestricted Somatic Stem Cells(USSCs)［J］.Stem Cells Dev，2010，19(6):877-885.

［19］Huang J，Zhao L，Xing L，et al.MicroRNA-204 regulates Runx2 protein expression and mesenchymal progenitor cell differentiation［J］.Stem Cells，2010，28(2):357-364.

［20］Luzi E，Marini F，Sala SC，et al.Osteogenic differentiation of human adipose tissue-derived stem cells is modulated by the miR-26a targeting of the SMAD1 transcription factor［J］.J Bone Miner Res，2008，23(2):287-295.

［21］Lin EA，Kong L，Bai XH，et al.miR-199a，a bone morphogenic protein 2-responsive MicroRNA，regulates chondrogenesis via direct targeting to Smad1［J］.J Biol Chem，2009，284(17):11326-11335.

［22］Miyaki S，Nakasa T，Otsuki S，et al.MicroRNA-140 is expressed in differentiated human articular chondrocytes and modulates interleukin-1 responses［J］.Arthritis Rheum，2009，60(9):2723-2730.

［23］Jones SW，Watkins G，Le Good N，et al.The identification of differentially expressed microRNA in osteoarthritic tissue that modulate the production of TNF-alpha and MMP13［J］.Osteoarthritis Cartilage，2009，17(4):464-472.

［24］Sugatani T，Hruska KA.Impaired micro-RNA pathways diminish osteoclast differentiation and function［J］.J Biol Chem，2009，284(7):4667-4678.