大腸癌基因治療研究進展

周 東（綜述），陳嘉勇（審校）

（昆明醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院急診科，昆明 650101）

大腸癌是人類常見惡性腫瘤之一，治療仍以手術切除為首選，但療效欠佳;基因治療因其效果佳，不良反應小，現(xiàn)已成為研究的熱點。目前，大腸癌基因治療的方法包括基因修正或基因置換、基因免疫治療、RNA干擾技術等。選擇腫瘤基因治療的理想載體和靶點，提高基因治療的安全性、靶向性、高效性和可調控性，是目前大腸癌基因治療需要解決的問題。

大腸癌;基因治療;病毒載體

基因治療是指通過操作遺傳物質來干預疾病的發(fā)生、發(fā)展和進程，包括替代或糾正人自身基因結構或功能上的錯亂，殺滅病變的細胞或增強機體清除病變細胞的能力等，從而達到治病的目的。大腸癌是常見的惡性腫瘤之一，在我國的消化道腫瘤發(fā)病率中排第三位，發(fā)病率仍有上升趨勢。大腸癌的治療至今仍以手術治療為首選，輔以放化療，但療效欠佳，患者生存率低下，其基因治療一直是研究的熱點，現(xiàn)將大腸癌基因治療的研究進展予以綜述。

1 大腸癌的基因治療

1.1 基因修正或基因置換 這是將正常功能基因通過載體轉染腫瘤細胞，置換或增補腫瘤細胞缺陷的基因，主要是以病毒為載體把野生型基因重新導入腫瘤細胞。p53是一種抑癌基因，參與細胞周期調控，在防止細胞癌變、抑制腫瘤血管生成、逆轉腫瘤耐藥性、增加放化療對腫瘤細胞的殺傷力、刺激機體特異性抗腫瘤免疫反應中發(fā)揮重要作用，是迄今發(fā)現(xiàn)的與人類腫瘤相關性最高的基因，其突變率平均為60%［1］。針對p53矯正來治療結直腸癌目前主要有兩種策略:①導入野生型 p53（wide type-p53，wt-p53）替代突變基因;②利用p53激活因子或核酶技術逆轉p53突變。大量體外培養(yǎng)細胞和動物模型都證實了外源的wt-p53導入后，腫瘤細胞增殖減慢，細胞發(fā)生凋亡，瘤體體積縮小，對放、化療藥物的敏感性增高。Okimoto等［2］經肝動脈給結腸癌RCN-9細胞肝轉移大鼠注入腺病毒介導的p53，48 h后注入順鉑，一段時間后，發(fā)現(xiàn)肝轉移癌細胞廣泛死亡，而肝功能沒有損害。Cook等［3］發(fā)現(xiàn)，一氧化氮能夠促進p53依賴性細胞凋亡，通過轉移一氧化氮合酶基因到結腸癌細胞內，誘導一氧化氮生成，激活p53，顯著抑制腫瘤生長。

1.2 自殺基因治療 又名基因介導的酶前藥物治療（gene-directed enzyme prodrug therapy，GDEPT），是一種通過目的基因的轉導，將外源酶轉入腫瘤細胞中，使無毒的前藥在腫瘤中代謝為有細胞毒性的藥物，從而殺死腫瘤細胞，這種基因轉導主要以病毒介導的酶/藥物前體療法（virus-directed enzyme prodrug therapy，VDEPT）。自殺基因轉染給腫瘤細胞將瘤細胞殺滅，此為直接細胞毒效應。在自殺基因/前藥系統(tǒng)介導的腫瘤治療中，被殺滅的細胞數(shù)遠超過表達自殺基因的細胞數(shù)，這是由于在前藥存在下，基因改造的瘤細胞能引起未經基因改造細胞的細胞毒性和死亡，這種現(xiàn)象即旁觀者效應。

GDEPT有下列3種成分:①能編碼一種酶的自殺基因:該基因通常來源于病毒或真核細胞，其編碼的酶能將無毒的前藥轉變?yōu)榛钚远疚铮鸢屑毎劳觯谌狈η八幍臈l件下，該基因的表達對機體無害;②基因轉移載體:為了轉移自殺基因至靶細胞，一般采用基因工程改造的反轉錄病毒、腺病毒和腺病毒相關性病毒作為載體;③能被自殺基因編碼的酶作用的前藥:這種前藥在自殺基因不存在時，對機體無毒或有微小毒性，而在自殺基因編碼的酶特異性作用下，前藥轉化為活性藥物，后者的細胞毒性較無活性的前藥至少強100倍。

目前應用的GDEPT主要有以下幾種:①丙氧鳥苷/單純皰疹病毒-胸苷激酶系統(tǒng);②氟胞嘧啶/胞苷脫氨酶系統(tǒng);③6-巰基嘌呤/黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶系統(tǒng);④丙氧鳥苷/潮霉素磷酸轉移酶-胸苷激酶融合蛋白系統(tǒng);⑤6-甲基嘌呤-2-脫氧核糖核苷酸/嘌呤核苷酸磷酸酶系統(tǒng);⑥環(huán)磷酰胺/細胞色素P450-B1系統(tǒng)。Sung等［4］在B超引導下將腺病毒單純皰疹病毒-胸苷激酶經皮直接注射至16例結直腸癌肝轉移灶中，其中2例患者有輕度的轉氨酶升高，5例有輕微發(fā)熱，3例有輕度白細胞減少，顯示了較高的安全性。胞苷脫氨酶將抗真菌藥氟胞嘧啶轉化成具有抗腫瘤活性藥物氟尿嘧啶，后者在DNA復制過程中抑制胸腺嘧啶合成酶而誘導細胞凋亡。許多體內體外實驗都證實，被轉染胞苷脫氨酶的細胞對氟胞嘧啶高度敏感，且存在很強的旁觀者效應。尿嘧啶磷酸核糖轉移酶能增強氟尿嘧啶轉變?yōu)榛钚孕问?-氟脫氧尿苷一磷酸鹽，抑制DNA的合成。將胞苷脫氨酶和尿嘧啶磷酸核糖轉移酶融合基因導入靶細胞表達，可能會增加氟胞嘧啶對腫瘤細胞的毒性。Chung-Faye等［5］將腺病毒-胞苷脫氨酶-尿嘧啶磷酸核糖轉移酶注射到裸鼠結直腸癌模型中并腹腔內注射氟胞嘧啶，顯著抑制了腫瘤生長。

1.3 基因免疫治療 機體抗腫瘤的免疫必須依賴于腫瘤細胞的抗原被機體免疫系統(tǒng)識別后激活。人類腫瘤免疫原性弱，且抗原呈遞中存在多個環(huán)節(jié)缺陷，從而使腫瘤出現(xiàn)免疫逃逸。將細胞因子或免疫相關基因導入腫瘤細胞制備腫瘤疫苗，可增強腫瘤細胞抗原性以及抗體對腫瘤抗原的識別和呈遞能力，增強機體抗腫瘤免疫能力。基因免疫治療的基本思路歸納如下。1.3.1 免疫相關基因導入腫瘤細胞 腫瘤抗原需與主要組織相容性復合物（major histocompatibility complex，MHC）Ⅰ類分子結合，被 CD8+細胞毒性 T淋巴細胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）識別成為抗原呈遞細胞，攝取加工后與MHCⅡ分子結合，被CD+T

4細胞識別，方可激活腫瘤免疫。60%～70%大腸癌患者的MHCⅠ呈低表達狀態(tài)，從而使腫瘤組織逃脫機體的免疫監(jiān)視，而 MHCⅠ和 MHCⅡ途徑都需 HLAB7（人類白細胞抗原B7）共刺激，腫瘤細胞導入MHC基因，可提高抗原呈遞能力，激活抗腫瘤免疫。單獨B7基因治療對無免疫原性的腫瘤細胞作用弱，若聯(lián)合MHC呈遞和B7基因共刺激作用，則可激活CTL廣泛的腫瘤殺傷效應，且B7分子還能增強自然殺傷細胞的腫瘤殺傷活性。

1.3.2 細胞因子基因導入腫瘤細胞 細胞因子具有廣泛的生物學效應，將編碼細胞因子的基因導入腫瘤細胞可構建腫瘤疫苗。白細胞介素2（interleukin-2，IL-2）的單獨皮下注射或靜脈注射主要引起毛細血管滲透性改變，并無明顯的抗腫瘤活性表現(xiàn)，但將編碼IL-2的基因導入大腸癌細胞構建腫瘤疫苗，經γ射線等處理后使其失去致癌性而保存分泌IL-2的能力。通過IL-2生物學活性，可誘導CTL、巨噬細胞和自然殺傷細胞的活性及抗體產生，增強抗腫瘤免疫效應。許多細胞因子基因（如IL-2基因、集落細胞刺激因子基因）在鼠結腸癌模型中已被證實有效［6］。

1.3.3 基因瘤苗 結直腸癌細胞缺乏B7分子，不能為T細胞的激活提供協(xié)同刺激信號，從而誘導T細胞無能。轉染B7基因的腫瘤細胞，具有直接激活CTL的能力。癌胚抗原是一種糖蛋白，在絕大多數(shù)結直腸癌組織中高表達，能被T細胞識別，將癌胚抗原基因轉染腫瘤細胞可提高其免疫原性。聯(lián)合轉染B7和癌胚抗原在理論上可以促進腫瘤特異性T細胞的激活。H?rig等［7］用重組有癌胚抗原和B7基因的復制缺陷型痘病毒對18例晚期結直腸癌患者進行肌內注射，在最高劑量4.5×108PFU（噬菌斑形成單位數(shù)，指每毫升試樣中含有侵染性噬菌體的粒子數(shù)）下沒有嚴重毒性作用及自身免疫反應，其中有3例患者病情穩(wěn)定，且證實與癌胚抗原特異性T前體細胞的增高有關，重復注射后出現(xiàn)癌胚抗原特異性T細胞應答的擴大效應。

1.4 反義基因治療 是指利用一些物質干擾細胞中遺傳物質信息天然加工的方法，尤其是在因基因變異所致疾病的情況下。其基本機制是通過阻抑從DNA到mRNA的轉錄過程或從 mRNA到蛋白質的翻譯過程而阻斷細胞中蛋白質的合成。利用這一技術所研制的藥物稱為反義藥物，通常指反義寡脫氧核苷酸（antisense oligodeoxy-nuclecotide，ASODN），其核苷酸序列可與基因組RNA或DNA或基因組衍生的RNA互補，防止或阻斷疾病相關蛋白的表達。Green等［8］的實驗發(fā)現(xiàn)，ASODN能阻撓結腸癌細胞β-聯(lián)蛋白mRNA功能，降低結腸癌胞質內β-聯(lián)蛋白表達水平，從而抑制β-聯(lián)蛋白進入核內與轉錄因子結合啟動下游靶基因轉錄，且ASODN對結腸癌的這種抑制作用呈劑量依賴性。

1.5 RNA 干擾（RNA interference，RNAi）技術RNAi現(xiàn)象最早在1998年由 Fire等［9］首次發(fā)現(xiàn)并命名，RNAi屬于轉錄后基因沉默機制，其本質是小分子干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）高效特異地阻斷體內同源基因表達，致使mRNA降解和基因表達受抑［10］。RNAi對腫瘤的作用機制包括可靶向抑制內源性基因和外源性癌基因［11］，針對信號通路的多個基因或基因族的共同序列同時抑制多個基因的表達，從而抑制腫瘤生長，通過腫瘤細胞生長分化相關的信號轉導通路，并通過干擾細胞信號轉導途徑中關鍵蛋白的表達，達到抑制腫瘤生長的作用。由于RNAi抑制基因表達具有特異性和高效性，同時伴隨近年來合成雙鏈RNA技術上的改進，RNAi已成為研究大腸癌基因治療的新方法。目前，生物體內siRNA給藥系統(tǒng)主要采用以下幾種方式:①陽離子脂質體包裹siRNA或siRNA質粒表達載體，前者的細胞毒性和兩者的低轉染效率限制了其應用;②病毒siRNA表達載體，如反轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒和慢病毒等，具有特異和高效的基因轉移率，RNAi效應高，并可在生物體內產生可持續(xù)的表達，但多數(shù)病毒類載體潛在的免疫原性和致瘤性問題一直未得到很好的解決。而慢病毒siRNA表達載體具有較低的免疫原性和細胞毒性，生物體內穩(wěn)定性比較好，適用于體內RNAi的研究，包括穩(wěn)定表達細胞株成瘤實驗、瘤內注射、局部注射等，是抑制特定基因表達的理想工具［12］。目前已發(fā)現(xiàn)，通過RNAi抑制K-ras、Bcl-2、p53等腫瘤相關基因能夠使大腸癌腫瘤細胞增生速度減慢，惡性程度降低，凋亡加快［13］。β-聯(lián)蛋白和抗原遞呈細胞基因是WNT信號轉導途徑的關鍵成分。這些基因的突變可引起β-聯(lián)蛋白表達水平的增加，導致細胞過度增生，促進結腸息肉和結腸癌的發(fā)展。有學者構建了β-聯(lián)蛋白基因的siRNA并轉染結腸癌細胞系 SW480和HCT116，結果發(fā)現(xiàn)，轉染siRNA后能顯著降低β-聯(lián)蛋白基因的表達并抑制癌細胞的增生［14］。siRNA可以針對β-聯(lián)蛋白基因的多個靶區(qū)域使得蛋白表達量降低90%。ASODN技術雖然也能用于抑制β-聯(lián)蛋白基因的表達，但其抑制效果明顯低于RNAi。RNAi可以單獨應用，或與其他治療手段聯(lián)合應用，RNAi正在替代ASODN技術及基因剔除技術在基因功能研究上的地位，而且作為腫瘤基因治療的新方法，其前景也是十分誘人的［15］。

1.6 抑制腫瘤血管生成基因治療 血管形成過程包括從內皮細胞的激活、增殖、遷移、血管基底膜的破壞，至血管和血管網的形成，由于多數(shù)腫瘤生長及轉移依賴于血管生成，因此，抗血管生成治療被成為一項頗具潛力的腫瘤治療措施。Schmitz等［16］利用腺病毒介導的內皮他丁和血管他丁相似分子基因轉導治療大鼠結腸癌和肝細胞癌，發(fā)現(xiàn)內皮他丁和血管他丁相似分子都能夠顯著抑制試管內內皮細胞的增殖及血管形成，而血管他丁相似分子抑制效果更顯著;同時發(fā)現(xiàn)血管他丁相似分子能夠抑制大鼠結腸癌細胞的生長。半乳凝素7是復層上皮細胞表達的β-半乳糖苷結合動物凝集素，是一種凋亡前體蛋白，p53基因可誘導它的表達。Ueda等［17］通過研究發(fā)現(xiàn)，半乳凝素7在人結腸癌DLD-1細胞系異位表達使得癌細胞更易于死亡，經半乳凝素7轉染的DLD-1細胞生長明顯減緩，而且細胞集落形成明顯減少，腫瘤血管密度減低，表明半乳凝素7是通過抑制血管生成而起作用的。

2 大腸癌基因治療存在的問題

盡管目前世界范圍內已有100余項基因治療方案獲準進入臨床試治腫瘤，但臨床仍缺乏有顯著療效的治療方案。其原因主要有以下幾方面。

①目前的基因治療載體主要分為病毒載體和非病毒載體，病毒載體轉染效率高，靶向性強，但其包裝能力小，易引起免疫反應;非病毒載體毒性低，具有低免疫原性，但轉染效率低，通過載體導入腫瘤細胞的基因表達量低等，且這些載體在體內均表現(xiàn)出毒性［18］，因此需要改進和尋找更加安全的載體。②大腸癌的發(fā)生跟其他惡性腫瘤一樣，是多基因水平的表達調節(jié)失控所致，其機制目前尚未完全被人們所認識，不可能置換所有突變基因，因此單基因的修正、置換效果仍不盡人意。③把癌胚抗原作為啟動子在轉基因表達中有較好的腫瘤特異性，但只有當大腸癌細胞表達癌胚抗原時才能發(fā)揮其啟動子的作用，而且臨床中癌胚抗原的啟動子作用效果很不明顯。④當前基因治療中還存在許多關鍵問題沒有解決，如對導入基因的可控性問題等。同時，基因治療的安全性也是一個不可忽視的問題，包括基因載體本身以及外源基因整合到宿主染色體帶來的一系列不良影響。⑤反義基因治療技術在腫瘤治療和病毒控制中顯示出了誘人的應用前景，但ASODN自身的穩(wěn)定性、給藥途徑及與非靶DNA或mRNA雜交而出現(xiàn)對機體不良反應等問題尚未最終解決。⑥RNAi技術的出現(xiàn)對腫瘤基因治療帶來了新的希望［19］，但RNAi用于臨床腫瘤治療目前仍要解決的問題是靶向性及提高RNAi的轉染效率，避免RNAi轉染后在細胞內的降解等。

3 大腸癌基因治療展望

大腸癌與其他惡性腫瘤一樣，是在內外多因素影響下發(fā)生的多基因表達調控失調的一種個體化的疾病，設計出合理治療方案極為重要。基因治療的核心問題是靶向性，隨著分子生物學和生物技術的發(fā)展及相關學科的相互滲透，針對大腸癌的基因治療已有多種方法，如胞苷脫氨酶/氟胞嘧啶、單純皰疹病毒-胸苷激酶/丙氧鳥苷體系的病毒介導的酶前藥物治療方案、wt-p53抑癌基因治療以及某些免疫

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