腫瘤壞死因子受體家族與脊髓損傷后的細胞凋亡信號傳遞

禹曉東(綜述)，許向東(審校)

(解放軍第三醫院骨科，陜西寶雞721004)

目前，脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)后的凋亡信號傳遞機制仍未完全明確。因此，了解SCI后上游凋亡信號如何傳遞以及傳遞途徑中的關鍵蛋白顯得尤為重要。這有利于針對性的選擇治療策略以減輕損傷、恢復神經功能。眾多的研究中，越來越多的目光集中于腫瘤壞死因子受體(tumor necrosis factor receptor，TNFR)家族，TNFR家族廣泛地參與由炎性反應和淋巴細胞激活導致的細胞凋亡和其他類型的程序性細胞死亡，依照不同的細胞類型及環境因素，這些受體產生不同的信號反應。

最近的研究揭示了TNFR家族的兩個成員，即TNFR-1和Fas信號轉導復合體的結構及其細胞定位［1］。胞外的多種生物化學信號通過TNFR-1和Fas復合體轉導入胞內，引起細胞凋亡。最近的一項研究中，將剔除TNFR-1和Fas或封閉TNFR-1和Fas與其配體的相互作用的動物制作SCI模型，與對照組相比，其神經功能評分明顯升高［2］。

1 Fas信號通路

Fas(CD95，Apo-1)屬于Ⅰ型跨膜蛋白，隸屬于TNFR家族，是已知的6個死亡受體之一。其胞外部分包含三個富半胱氨酸區域(cysteine-rich domains，CRDs)，其中CRD 1是Fas配體結合區域，當Fas構成三聚體后，可與Fas配體結合，CRD 2和CRD 3也在Fas與其配體的結合中發揮重要作用［3］。Fas在胞內的部分稱為死亡結構域(death domain，DD)，通過可與其結合的蛋白傳遞早期凋亡信號。Fas的典型配體稱為 FasL(CD95L，Apo-1L，CD178，TNFSF6)，這是一個281氨基酸長度的Ⅱ型跨膜蛋白，特異性的定位于免疫細胞和CNS細胞膜上［4］。

在神經系統中，Fas的激活可以引發神經元與膠質細胞的凋亡［5］。目前對于淋巴細胞凋亡中經Fas途徑的信號傳遞機制已比較清楚，但對其在CNS內的信號傳遞方式及其時空定位仍未完全明確。但無論如何，Fas和FasL在SCI后的神經元與神經膠質細胞凋亡過程中發揮了關鍵性作用，這是毋庸置疑的。眾多研究揭示，Fas與FasL無論是在體外培養的神經元或膠質細胞，還是在體內CNS內均有表達，但表達水平在正常狀態下極其低下。與其相反，包括SCI在內的多種CNS損傷或疾病狀態下，可檢測到Fas與FasL表達水平的顯著升高［6］。

新的試驗證據顯示，應用FasL的中和劑可以顯著減少SCI后神經元與膠質細胞的凋亡數量和凋亡范圍。試驗中，SCI大鼠于傷后使用FasL的單克隆抗體處理，數周后測量其后肢運動功能與動作誘發電位，均優于未經任何處理的對照組，對其脊髓標本進行研究后發現，其神經纖維的再生數量與生長相關蛋白43表達水平均高于對照組［7］。Yoshino等［8］采用剔除Fas和FasL的轉基因鼠制作SCI模型，發現與對照組相比，轉基因鼠SCI后損傷范圍減小、細胞凋亡數量減少、神經功能恢復速度增加。這說明Fas和FasL在SCI后的神經元與神經膠質細胞凋亡中發揮關鍵作用。但其具體機制仍需要進一步研究:損傷后FasL的來源及其作用靶位需進一步明確;損傷后軸突再生與運動功能恢復的相關性亦需深入探討;再者，在上述試驗中，FasL抗體是于損傷后即刻應用，那么，需要進一步的試驗說明FasL抗體最晚可于損傷后多久應用才能取得理想的治療效果，這有利于制訂精確的藥物治療方案。

Fas介導的信號轉導由死亡介導信號復合體(death-inducing signal complex，DISC)完成，包括 Fas、Fas相關死亡結構域(Fas-associated death domain，FADD)、caspase-8、caspase-10。其轉導效率在不同類型的細胞內存在差異。在“Ⅰ型”細胞內，Fas激活后DISC表達量高，轉導效率高，且其介導的凋亡過程不能被Bcl-2家族蛋白阻斷;而在“Ⅱ型”細胞內，DISC在Fas激活后表達量較低，轉導效率較低，凋亡過程可被Bcl-2家族蛋白阻斷［9］。CNS內為何存在兩種不同的Fas凋亡轉導效率，其分子機制仍不明確。

Fas在細胞膜上的定位差異可能是存在兩種不同轉導效率的原因之一。將T細胞膜上的Fas蛋白通過特殊技術轉移到某一特定區域后，其在相同胞外信號強度刺激下的凋亡數量明顯增加［10］。進一步的試驗證實，在“Ⅰ型”細胞中，一部分Fas定位于胞膜的卵磷脂區域內，而在“Ⅱ型”細胞中，全部Fas均未定位于卵磷脂區域。正是定位于卵磷脂區域的Fas可介導“Ⅰ型”細胞在極低強度的胞外信號作用下發生凋亡，而同樣強度的信號并不能導致“Ⅱ型”細胞的凋亡［11］。那么，CNS內是否明確存在“Ⅰ型”和“Ⅱ型”細胞以及為何卵磷脂區域可以提高Fas對凋亡信號的敏感性尚需進一步的研究。可以想象，進一步深入對Fas和FasL及其作用靶位的研究將極大地推動SCI治療的進展。

2 阻斷Fas信號通路的研究進展

人們已經對數種阻斷了Fas信號途徑的細胞模型進行了詳細的研究，包括將細胞膜上的Fas溶解或是使細胞分泌可以競爭性地結合FasL的蛋白。研究者采用腺病毒蛋白E3降解Fas后，觀測到了細胞凋亡率的降低［12］。此外，蛋白激酶C也可以調節Fas介導的凋亡過程，蛋白激酶C活化后通過減少Bid蛋白的活化抑制Fas介導的細胞凋亡。值得注意的是，這種效應僅出現于“Ⅱ型”細胞，而在“Ⅰ型”細胞中并無任何影響［13］。由此推測，蛋白激酶C可能是通過影響Bcl-2蛋白表達來達到抑制凋亡的目的。

細胞內的長鏈型FLIP(FLICE-like inhibitory protein long form，c-FLIPL)近來日益受到重視，c-FLIPL包含一個死亡效應結構域，在Fas介導的凋亡信號通路中可能同時扮演了啟動子與沉默子的角色［14］。除c-FLIPL之外，另外一種被稱為lifeguard的蛋白也可以阻斷Fas介導的凋亡信號通路，lifeguard可以直接結合于Fas受體上，阻止Fas和FasL之間的結合［15］。在大鼠體內，lifeguard的同源蛋白又被稱為神經膜蛋白35，它隨著大鼠CNS的發育表達量不斷上調，并且在成年大鼠的脊髓內呈穩定的高表達狀態，尤其在數種類型的神經元樹突中表達量最高［16］。研究發現，lifeguard蛋白的表達主要受磷脂酰肌醇3激酶-AKT/PKB途徑的調節［17］。在大鼠體內，lifeguard蛋白在小腦的顆粒樣神經元中表達量最高，而對這類顆粒樣神經元的體外培養也證實，其具有對抗Fas介導的細胞凋亡的能力［18］。而進一步的試驗中，研究者采用編碼lifeguard蛋白mRNA的反義寡核苷酸對培養的大鼠小腦顆粒樣神經元進行轉染，以及采用RNA沉默技術使lifeguard蛋白的表達量下調，均檢測到了細胞對Fas介導的細胞凋亡的敏感性的升高以及Fas下游caspase-8活化量的增加［19］。這說明lifeguard蛋白在顆粒樣神經元對抗Fas介導的細胞凋亡過程中發揮了重要作用，至于lifeguard蛋白是否也會在其他類型的神經元中發揮類似的凋亡保護作用，尚需進一步的試驗證據。

3 TNFR信號通路

關于TNFR1和TNFR2在正常或SCI后的脊髓內的表達，目前仍存在爭議。Yan等［20］報道，在正常脊髓中并沒有明確的檢測到TNFR1和TNFR2的表達;而與之相反，有研究發現，在正常脊髓的DRGn傳入纖維、背根移行區以及脊髓后角的薄層Ⅰ區和Ⅱ區均檢測到了TNFR1表達，但并無TNFR2存在證據［21］。SCI后，TNFR1 和 TNFR2的表達量顯著升高，并局限性地定位于神經元、星形膠質細胞及少突膠質細胞內，這提示TNFR1和TNFR2可能在SCI后的病理學變化中發揮重要作用。在一項試驗中，采用剔除TNFR1的轉基因鼠制作SCI模型，與使用野生型鼠的對照組相比，試驗組細胞凋亡數量、神經損傷范圍均遠大于對照組，神經功能恢復能力則較對照組為差。進一步對兩組損傷局部進行研究后發現，轉基因組出現了核因子κB結合活性的降低，同時還有cIAP-2表達量的降低以及caspase-3活化的增加。類似的結果也出現在剔除編碼TNFR2蛋白序列的轉基因鼠SCI模型中［22］。以上的研究結果支持了TNFR1和TNFR2可能在SCI后限制細胞凋亡范圍的觀點。

有研究顯示，TNFR1信號途徑包含兩個分子結構和空間定位都不相同的分子復合體，這兩個復合體分別激活核因子κB與caspase系統［23］。在凋亡信號傳遞早期，TNF與 TNFR1結合后，一個包括TRADD、RIP1、TRAF1、TRAF2 和 cIAP-1 的 TNFR 受體相關復合體Ⅰ開始啟動并轉導胞外信號，引發核因子κB的活化，參與抑制凋亡進程。而另外一個復合體Ⅱ則存在于胞質內，與TNFR分離，由TRADD、RIP1、FADD和caspase-8組成，參與另外一條TNFR1相關的信號轉導途徑。當復合體Ⅰ轉導胞外信號，引發核因子κB的活化數量足夠時，胞內的抗凋亡機制激活，復合體Ⅱ中caspase-8的活化受到抑制;而當復合體Ⅰ轉導胞外信號，引發核因子κB的活化數量微少時，復合體Ⅱ中的caspase-8則開始活化，參與促進凋亡進程。由此可見，核因子κB的活化數量是決定復合體Ⅱ是否參與TNFR1相關的信號轉導途徑、從而誘導凋亡的最關鍵因素。

SCI后，脊髓神經元TNFR1相關信號轉導途徑被激活，其結局究竟是存活還是凋亡?最近的試驗對其進行了更加深入的研究［24］。結果顯示，有一部分TNFR1定位于細胞膜上的卵磷脂區域內。已經證實，卵磷脂區域可作為包括FAS、TNFR1在內的多種信號轉導受體存在的平臺。在正常脊髓內，TNFR1信號轉導復合體包括 TRADD、RIP、TRAF1、TRAF2和 cIAP-1，而已知在體內由 TNFR1-TRADD-RIPTRAF2復合體傳遞的為細胞存活信號，由此有理由推測，TNFR1信號途徑在正常脊髓內實際是促進細胞存活的信號途徑。

SCI后，TNFR1快速移位至細胞膜的卵磷脂區域，通過信號轉導復合體引起一過性的核因子κB活化數量增加，然后RIP和cIAP-1自TNFR1上解離，而cIAP-2、FADD則與TNFR1結合，開始介導細胞凋亡［25］。由此認為，TNFR1信號途徑在正常脊髓內促進細胞存活，而在SCI后導致細胞凋亡，這種變化是由TNFR1信號轉導復合體中銜接蛋白的變化導致的。RIP與TNFR1的解離可能是導致核因子κB途徑表達下調，致使細胞凋亡增加的始動因素。而且，cIAP-1、IAP-2和TRAF1已經被證實是核因子κB的作用靶位，SCI導致的核因子κB活化的下調也可能同時導致TNFR1-TRAF-IAP對caspase-8活化抑制能力的下調，從而使caspase-8活化增加，致使細胞凋亡。SCI后30 min，caspase-8即可被檢測出定位于TNFR1信號轉導復合體中，這也證實了FADD通過與TRADD結合，激活caspase-8從而誘導凋亡的推測［26］。有學者曾通過對培養狀態下神經元的研究發現，TNFR1信號途徑包含兩個分子結構和空間定位都不相同的分子復合體，分別發揮不同作用，然而在體內試驗中，并未發現這兩種復合體如同在體外般的顯著區別。在試驗中發現，復合體Ⅰ在SCI 30 min后即可激活 caspase-8誘導凋亡［27］。因此，在 SCI后，TRADD的死亡結構域可能在FADD及caspase-8的活化過程中起著決定性的調控作用。此外，TNFR信號途徑也受到所在細胞類型、其他信號轉導途徑、遺傳與環境因素等多方面的影響。

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