溶瘤腺病毒治療膀胱癌進展

陳 猛，郝 林(綜述)，韓從輝※(審校)

(1.東南大學醫學院，南京210009;2.東南大學醫學院附屬徐州醫院泌尿外科，江蘇徐州221009)

膀胱腫瘤是我國泌尿外科最常見的腫瘤，約占全部惡性腫瘤的3.2%，且發病率逐年增高。在歐美一些國家，膀胱腫瘤在泌尿生殖系統中僅次于前列腺癌而居第二位。目前，治療膀胱癌的主要方法是以手術為主，輔以膀胱內灌注化療和免疫治療藥物，但復發率高，治療效果遠不能讓人滿意。溶瘤腺病毒又稱條件增殖型腺病毒，其在正常細胞中復制能力很低而在腫瘤細胞中則可以特異性復制，通過腺病毒的增殖來裂解腫瘤細胞，釋放出的子代腺病毒可以繼續感染周圍腫瘤細胞進一步殺傷腫瘤。自2003年首次報道溶瘤腺病毒治療膀胱腫瘤以來，人們對溶瘤腺病毒治療膀胱癌進行了大量的研究。

1 腺病毒的生物學特征及特點

腺病毒(adenovirus)是一種由252個殼粒呈二十面體排列構成的直徑為70～90 nm的無包膜雙鏈DNA病毒。腺病毒具有以下諸方面的優點:①嗜上皮細胞性;②既可以感染分裂期細胞又可以感染非分裂期細胞;③對人致病性低;④同時表達多個基因;⑤外源性基因表達水平高;⑥插入外源基因容量大;⑦病毒基因組發生重排較少;⑧有效進行增殖;⑨滴度高;⑩不整合到宿主染色體。人體腺病毒目前已經鑒定有51個血清型。這51型腺病毒可以根據血凝反應、對嚙齒類動物的致瘤性、DNA的同源性和基因組的結構分為 A、B、C、D、E、F亞屬。目前應用的腺病毒載體主要是在人類腺病毒C亞群的Ad2和Ad5的基礎上構建的。

腺病毒對細胞的感染始于纖維蛋白與靶細胞表面的腺病毒受體(coxsackievirus-adenovirus receptor，CAR)結合，腺病毒黏附后，五鄰體蛋白上的精氨酸-谷氨酸-天冬氨酸序列與細胞表面的整合素ανβ3和ανβ5結合形成內體使病毒進入細胞，CAR起到黏附病毒的作用，整合素起到了內化病毒的作用，他們各司其職，相互配合。兩者對于腺病毒的感染是缺一不可的。

2 溶瘤腺病毒的構建機制

目前認為，細胞由G1期進入S期，是腺病毒復制的必要條件。E2F轉錄因子可使細胞從G1期進入S期，而視網膜母細胞瘤(retinoblastoma，Rb)蛋白可與E2F結合，阻止細胞進入S期。腺病毒感染細胞后，E1A蛋白與Rb蛋白結合釋放E2F，促進細胞由G1期進入S期，但E2F同時也促進p14ARF和cyclin E等物質的產生，其中p14ARF通過Mdm2(泛素連接酶途徑)減少p53降解并在核仁周圍聚積;p53與細胞周期停滯基因和凋亡誘導基因上游的p53反應子結合從而阻止細胞進入S期或誘導細胞凋亡。而E1b蛋白可與p53結合并使之失活，最終使大量宿主細胞由靜止期進入分裂期，腺病毒得以復制。

可見E1A和E1B基因是腺病毒在正常細胞中復制所必需的基因，通過改變或調控E1A和(或)E1B基因就可以構建相應的溶瘤腺病毒，如去除E1A或E1B基因的腺病毒在Rb和p53細胞信號通路正常的宿主細胞中無法進行復制增殖，但在Rb或p53信號通路異常的腫瘤細胞中則可以增殖并使細胞受損。

3 溶瘤腺病毒治療膀胱癌的研究

3.1 E1B缺失腺病毒治療膀胱癌 p53基因突變是人膀胱癌中最常見的基因缺陷，大約50%的膀胱癌發生p53基因突變，且p53基因突變與移行細胞癌的高分期、高分級相關。腺病毒的E1B-55蛋白可以結合p53并使之失活，從而促使腺病毒復制。Hsieh等［1，2］構建了 E1B 缺失腺病毒 Ad5WS1，研究發現Ad5WS1可在p53突變的J82和TCC-SUP細胞中復制，J82細胞中的腺病毒產量是在293細胞中的10.34倍，但在TSGH-8301和BFTC-905中分別是293細胞的0.87%和1.52%。BFTC-173-12細胞感染Ad5WS1出現嚴重的細胞病變效應:感染3 d后，細胞生存率降到了50%。

3.2 E1A突變腺病毒治療膀胱癌 Fueyo等［3］通過刪除E1A區域的24 bp構建了溶瘤腺病毒Δ24，Δ24腺病毒可以高效地在腫瘤細胞中復制并溶解腫瘤細胞。研究顯示，Δ24感染人膠質瘤細胞10～14 d后可觀察到大多數的腫瘤細胞溶解。體內實驗也顯示，單劑量使用Δ24腺病毒可導致裸鼠66.3%的腫瘤生長抑制，而多次注射Δ24腺病毒抑制腫瘤生長可高達83.8%。但正常的成纖維細胞和Rb活性正常的癌細胞可抵抗 Δ24腺病毒。Wang等［4］研究發現，E1A突變腺病毒dl 922-947對膀胱癌細胞株J82 5637和T24的細胞病變效應要大于E1B-55KD缺失腺病毒AxE1AdB，但未報道這種差異是否有統計學意義。

3.3 E1A突變和E1B缺失雙限制腺病毒治療膀胱癌 Wang等［4］構建了E1A突變和E1B-55缺失腺病毒 AxdAdB-3，并以 E1區缺失腺病毒 AxCAlacZ，E1B-55缺失腺病毒 AxE1AdB和E1A突變腺病毒dl 922-947為對照組進行體外和體內研究AxdAdB-3的治療膀胱癌效果。體外研究結果顯示，AxdAdB-3比AxE1AdB和dl922-947有更大的細胞病變作用;體內研究結果顯示，AxdAdB-3治療的膀胱腫瘤體積最小，重量比對照組明顯減小。AxdAdB-3治療的小鼠生存率明顯增加，且多次灌注比單次灌注更明顯的增加了小鼠的生存率。此外，AxdAdB-3比單突變腺病毒對正常細胞有更小的毒性。

3.4 特異性啟動子調控溶瘤腺病毒治療膀胱癌Terao等［5］構建了由肝素結合細胞因子(midkine，MK)啟動子控制E1A基因的腺病毒(Ad-MK-E1A)并檢測了Ad-MK-E1A在細胞中的復制能力，轉染率以及細胞毒性。結果發現MK mRNA高表達的細胞系(KK47，5637)比MK mRNA低表達的細胞系(T24，H891)含有更多的E1A DNA;對KK47、5637、T24、A549 和H891 細胞的轉染率分別為(3.2×1010±0.9×1010)BTU/mL，(5.7 ×109±0.7 ×109)BTU/mL，1.0 ×107BTU/mL，(1.35×109±0.35 ×1010)BTU/mL，和(3.8 ×109±0.1×109)BTU/mL;Ad-MK-E1A不能抑制H891細胞的生長，在第7 天，21%的 T24，35.5%的 A549，56.8%的KK47和71.6%的5637細胞生長被抑制。隨后用KK47細胞建立了皮下腫瘤動物模型進行動物實驗研究，結果Ad-MK-E1A明顯抑制腫瘤生長。

Shirakawa等［6］構建了由環氧化酶2(cyclooxygenase 2，Cox-2)啟動子控制E1A基因的腺病毒(AdE3-cox2-327)。體外實驗發現，AdE3-cox2-327不能抑制T24、PC3、Colo320、PF 和 H358 細胞生長，但能明顯抑制表達Cox-2和CAR的KK47，5637和A549細胞生長。KK47、5637和A549細胞比H358細胞含有更多的E1A DNA，這證實了AdE3-cox2-327是有選擇性地復制。體內試驗發現，AdE3-cox2-327比Ad5CMV-LacZ和空白對照組更能抑制KK47腫瘤的生長。

Oct-3/4高表達于膀胱腫瘤，而不表達于正常成熟細胞組織，它在腫瘤生成過程中起著重要的作用［7，8］。Wu 等［9］構 建 了 由 ORE(Oct-3/4 response element)結合CMVmini啟動子控制的E1B缺失腺病毒Ad.9OC。研究發現，Ad.9OC的細胞溶解性效應與Oct-3/4的表達水平呈正相關。進一步實驗證實了Ad.9OC比Ad5WS1(E1B-55×103闕如腺病毒)具有更強的細胞溶解性效應。動物實驗發現，Ad.9OC增加了MBT-2/LM7腫瘤小鼠的生存率，但僅少許增加了MBT-2腫瘤小鼠的生存率。

Ramesh等［10］用 E2F-1啟動子和編碼 GM-CSF的cDNA分別取代了Ad5的E1A啟動子和E3gp19×103編碼區構建了溶瘤腺病毒CG0070。研究發現在Rb途徑缺陷的細胞中，CG0070中的E2F啟動子可以調控E1A基因的轉錄和下游調節人GMCSF的E3啟動子的表達。在Rb途徑缺陷的人膀胱移行細胞癌細胞系RT4、SW780、UC14和253J B-V中，CG0070和野生型腺病毒Ad5一樣產生相似水平的子代病毒(3000～9000 PFU/細胞);而在Rb陽性的正常細胞中，CG0070的復制能力急劇衰弱。以3×1010、3×109、3×108的 CG0070病毒量和磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)分別瘤內注射治療進行動物實驗研究，發現60 d后PBS組的腫瘤體積增加了10.6倍，3×109、3×108CG0070Z 組的腫瘤體積增加了2倍，而3×1010CG0070組的腫瘤體積降至85%;最高劑量CG0070治療組有一半(5/10)腫瘤完全退化。

Melquist等［11］構建了由骨唾液蛋白(bone sialoprotein，BSP)啟動子調控 E1A基因的腺病毒Ad-BSP-E1A。研究發現BSP陰性，CAR陽性的253J和253J B-V細胞易于感染Ad-BSP-E1A，BSP和CAR陰性的T24細胞是耐Ad-BSP-E1A的。BSP和CAR陽性的RT4細胞非常易感Ad-BSP-E1A。動物試驗中PBS和Ad-BSP-TK治療3周后的腫瘤平均體積分別增加了140%和67%，而Ad-BSP-E1A組減少了10%。治療7周后，PBS組腫瘤體積增加了2000%，而Ad-BSP-E1A和Ad-BSP-TK組分別增加了45%和76%。但由于樣本量較小，難以評估其統計學意義。

尿溶蛋白(uroplakins，UPs)是一組哺乳動物尿路上皮分化時合成的高度保守的膜內在蛋白。Zhang等［12］在E1A上游插入hUPⅡ啟動子，用TRES連接E1A和E1B區構建了腺病毒CV876，而后在CV876的基礎上刪除E1B-19×103編碼區構建了腺病毒CG8840。實驗結果說明，CV876和 CG8840在 RT4和SW780細胞中能很好地復制，但在非膀胱細胞中(G316、LNCaP、hLFs和 hBSMCs)復制能力很差。CG8840在膀胱癌細胞中比CV876有更大的病毒釋放量，而在非膀胱癌細胞中復制能力相似。動物實驗發現，CG8840瘤內注射治療5周后腫瘤體積減小到50%而空白對照組腫瘤體積增加到310%。聯合治療試驗顯示多西紫杉醇治療10 d后存活了50%的細胞，而多西紫杉醇聯合CG8840治療10 d后，全部細胞被殺死。等效線圖解法說明CG8840和多西紫杉醇具有協同作用。同樣，CG8840聯合其他化療藥物，如多柔比星、絲裂霉素C、塞替哌、米托蒽醌和長春堿也具有協同作用。動物實驗研究表明，治療7周后，空白對照組腫瘤增加320%，然而CG8840和聯合組(CG8840聯合多西紫杉醇)腫瘤減小甚至沒有腫瘤。治療5周時，CG8840組的6只小鼠中有2只觸及不到腫瘤，還有2只小鼠的腫瘤減小了50%以上;聯合組的6只小鼠中3只小鼠沒有腫瘤，另外3只小鼠的腫瘤減小了80%。由于UPⅡ也表達于正常的膀胱組織，Wang等［13］在UPⅡ啟動子上游插入腫瘤特異性前列腺干細胞抗原強化因子來限制其在非膀胱細胞中的活性。研究表明，腫瘤特異性前列腺干細胞抗原強化因子聯合UPⅡ啟動子構建膀胱癌特異性載體是可行的。

Lanson等［14］用人端粒酶反轉錄酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)啟動子調控E1基因的表達構建了腺病毒Ad5-hTERT-E1。研究表明，Ad5-hTERT-E1可以在所有的腫瘤細胞中(HT-1080、HeLa、A549、HepG2、SCC-4、SCC-5、SCCLSU-1、T24 和DU145)導致細胞溶解而對正常細胞(成纖維細胞、呼吸道上皮細胞和骨髓間質干細胞)則沒有作用。

在腫瘤增殖過程中發生缺氧是一種普遍現象，此時細胞內許多基因的轉錄和表達發生變化，對缺氧作出應激反應，這些反應主要是通過缺氧啟動子1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)完成的。李懷富等［15，16］研究30 例正常膀胱組織未發現 HIF-1α 陽性表達，80例膀胱組織中有43例HIF-1α表達陽性，陽性表達率占53.75%。其表達與腫瘤的大小、部位、數目、病理分級以及患者年齡無關，但與腫瘤的臨床分期及分級明顯相關。隨后構建了由hTERT啟動子控制E1A基因，HIF-1啟動子控制E1B基因的雙調控溶瘤腺病毒，使其更加特異地在腫瘤細胞中表達而在正常細胞中不表達，并以此為超抗原SEA基因載體進一步包裝成溶瘤腺病毒-hTERT-缺氧啟動子-超抗原復合物(RSOAds-hTERT-HIF-SEA)，該復合物既具有高效的靶向膀胱腫瘤特點，又具有強大的細胞毒T淋巴細胞刺激能力，同時又能夠直接裂解殺傷腫瘤細胞，進而對膀胱腫瘤細胞產生強大的多重靶向治療效果。胡建鵬等［17］將淋巴細胞與膀胱腫瘤細胞共培養12、24、48 h，加入該溶瘤腺病毒組的腫瘤細胞明顯少于對照組，酶聯免疫吸附法檢測白細胞介素4分泌量，實驗組均高于對照組。

4 存在的問題和展望

首先，膀胱上皮的氨基葡聚糖層作為非特異性隔離屏障可能阻礙腺病毒的感染能力，十二烷基-β-D麥芽糖苷或十二烷基硫酸鈉預處理的膀胱使用腺病毒15 min后有＞90%膀胱層轉染腺病毒，而未處理的膀胱≤5%轉染腺病毒［18，19］。不過使用藥物消除或減弱氨基葡聚糖層可以使腺病毒到達膀胱上皮表面而提高治療效果。

其次，膀胱癌的CAR表達下降將降低溶瘤腺病毒的感染能力，進而影響到治療效果。Li等［20］研究發現，RT4和253J膀胱癌細胞株易于感染腺病毒，而TCC和T24膀胱癌細胞株卻抵抗腺病毒感染，而后檢測到RT4細胞的CAR是T24的20倍左右。Sachs等［21］報道正常膀胱上皮、淺表性膀胱癌和浸潤性膀胱癌的CAR表達分別為90.0%、83.3%和31.3%，低分級TCC和高分級TCC細胞的CAR表達分別為83.3%、39.5%，CAR的表達與膀胱癌的分期與分級相關。因此，如何增加腺病毒治療低表達甚至不表達CAR的膀胱癌也是一個急需解決的問題。Shieh等［22］研究發現，低劑量的依托泊苷可以上調膀胱癌的CAR表達水平。此外，改變腺病毒的感染途徑也可以增加它對CAR缺乏細胞的感染性和特異性，一種方法是修飾腺病毒基因組來改變腺病毒衣殼的結合特異性，另一種是在腺病毒的衣殼上銜接一個具有特異性結合親和力的耦聯蛋白。

最后，溶瘤腺病毒治療膀胱癌還需要大量的臨床試驗，將溶瘤腺病毒用于臨床治療膀胱癌還有一段距離。相信，隨著科學的進步，對膀胱癌研究的深入和生物工程、基因工程的發展，總有一天人們會攻克膀胱癌。

［1］Hsieh JL，WU CL，Lai MD，et al.Hepatitis B virus X protein sensitizes hepatocellular carcinoma cell to cytolysis induced by E1B-deleted adenovirus through the disruption of p53 function［J］.Clin Cancer Res，2003，9(1):338-345.

［2］Hsieh JL，Wu CL，Lai MD，et al.Gene therapy for bladder cancer using E1B-55kD-deleted adenovirus in combination with adenoviral vector encoding plasminogen kringles 1-5［J］.Cancer Res，2003，88(9):1492-1499.

［3］Fueyo J，Gomez-Manzano C，Alemany R，et al.A mutant oncolytic adenovirus targeting the Rb pathway produces anti-g lioma effect in vivo［J］.Oncogene，2000，19(1):2-12.

［4］Wang H，Satoh M，Abe H，et al.Oncolytic viral therapy by bladder instillation using an E1A，E1B double-restricted adenovirus in an orthhotopic bladder cancer model［J］.Urology，2006，68(3):674-681.

［5］Terao S，Shirakawa T，Kubo S，et al.Midkine promoter-based conditionally replicative adenovirus for targeting midkine-expressing hunman bladder cancer model［J］.Urology，2007，70(5):1009-1013.

［6］Shirakawa T，Hamada K，Zhang Z，et al.A cox-2 promoter-based replication-selective adenoviral vector to target the cox-2-expressing human bladder cancer cells［J］.Clin Cancer Res，2004，10(13):4342-4348.

［7］Gidekel S，Pizov G，Bergamn Y，et al.Oct-3/4 is a dose-dependent oncogenic fate determinant［J］.Cancer Cell，2003，4(5):361-370.

［8］Atlasi Y，Mowla SJ，Ziaee SA，et al.Oct-4，an embryonic stem cell marker，is highly expressed in bladder cancer［J］.Int J Cancer，2007，120(7):1598-1602.

［9］Wu CL，Shieh GS，Chang CC，et al.Tumor-selective replication of an oncolytic adenovirus carrying Oct-3/4 response elements in murine metastatic bladder cancer model［J］.Clin Cancer Res，2008，14(4):1228-1238.

［10］Ramesh N，Ge Y，Ennist DL，et al.CG0070，a conditionally replicating granulocyte macrophage colony-stimulating factor-armed oncolytic adenovirus for the treatment of bladder cancer［J］.Clin Cancer Res，2006，12(1):305-313.

［11］Melquist JJ，Kacka M，Malaeb BS，et al.Conditionally replicating adenovirus-mediated gene therapy in bladder cancer:an orthotopic in vivo model［J］.Urol Oncol，2006，24(4):362-371.

［12］Zhang J，Ramesh N，Chen Y，et al.Identification of human uroplakinⅡ promoter and its use in the construction of CG8840，a urothelium-specific adenovirus variant that eliminates established bladder tumors in combination with docetaxel［J］.Cancer Res，2002，62(13):3743-3750.

［13］Wang D，Wang Z，Tian J，et al.Prostate stem cell antigen enhancer and uroplakinⅡpromoter based bladder cancer targeted tissuespecific vector［J］.Urol Oncol，2010，28(2):164-169.

［14］Lanson NA Jr，Fridlander PL，Schwarzenberger P，et al.Replication of an Adenoviral vector controlled by the human telomerase reverse transcriptase promoter causes tumor-selective tumor lysis［J］.Cancer Res，2003，63(22):7936-7941.

［15］李懷富，韓從輝，董秉政，等.缺氧啟動子-1α在膀胱癌中的表達及其意義［J］.中華實驗外科雜志，2009，26(3):361-362.

［16］李懷富，韓從輝，郝林，等.表達金黃色葡萄球菌腸毒素A基因的高靶向、雙調控溶瘤腺病毒載體的構建、鑒定及其抗膀胱腫瘤作用［J］.中華實驗外科雜志，2009，26(8):1052-1054.

［17］胡建鵬，郝林，張培影，等.雙調控溶瘤腺病毒介導超抗原SEA基因靶向膀胱腫瘤表達［J］.中華實驗外科雜志，2010，27(8):1131-1133.

［18］Lilly JD，Parsons CL.Bladder surface glycosaminoglycans is a human epithelial permeability barrier［J］.Surg Gynecli Obstet，1990，171(6):493-496.

［19］Ramesh N，Memarzadeh B，Ge Y，et al.Identification of pretreatment agents to enhance adenovirus infection of bladder epithelium［J］.Mol Ther，2004，10(4):697-705.

［20］Li Y，Pong RC，Bergelson JM，et al.Loss of adenoviral receptor expresiion in human bladder cancer cell:a potential impact on the efficacy of gene therapy［J］.Cancer Res，1999，59(2):325-330.

［21］Sachs MD，Rauen KA，Ramamurthy M，et al.Integrin аν and coxsackie adenovirus receptor expression in clinical bladder cancer［J］.Urology，2002，60(2):531-556.

［22］Shieh GS，Shiau AL，Yo YT，et al.Low-dose etoposide enhances telomerase-dependent adenovirus-mediated cytosine deaminase therapy through augmentation of adenoviral infection and transgene expression in a syngeneic bladder tumor model［J］.Cancer Res，2006，66(20):9957-9966.