rhddADAM15蛋白抑制小鼠黑色素瘤細胞生長及其機制

吳 靜，雷艷麗，金 堅，鄔敏辰，陳 偉

(江南大學1.醫藥學院，2.工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122)

金屬蛋白酶去整合素家族(A disintegrin and metalloproteinase，ADAM)是近年來新發現的一類在哺乳動物中廣泛表達的跨膜糖蛋白家族，具有降解細胞外基質、釋放細胞因子和介導信號轉導等多種生物學功能［1］。在已發現的30多種ADAM家族成員中，ADAM15在人類多種實體瘤細胞(如乳腺癌、前列腺癌和直腸癌等)中過量表達;該蛋白包含7個功能結構域:前導域、類金屬蛋白酶功能域、去整合素功能域、富含半胱氨酸功能域、類表皮生長因子功能域、跨膜域和C端的胞質尾區，其中去整合素結構域中含有整合素(Integrin)家族蛋白的特異識別序列〔RGD序列(Arg-Gly-Asp)〕，具有典型的藥物分子靶點結構與特征，有望用于指導抗腫瘤藥物的研究與開發［2］。有研究報道ADAM15與黑色素瘤細胞轉移和新生血管的形成密切相關［3-5］，但是國內外關于 ADAM15對黑色素瘤細胞作用機制的研究報道并不多見。由于天然來源的ADAM15蛋白十分有限，獲得大量具有生物活性的重組ADAM15或其片段蛋白對深入研究ADAM15在腫瘤發展變化中的作用機制，指導新型靶向抗腫瘤藥物的研制具有重要意義。作者在前期研究工作中，已經報道了制備重組人ADAM15去整合素結構域蛋白(rhddADAM15)的方法［6］。本文以小鼠黑色素瘤細胞(B16)為研究模型，采用經典分析方法，解析rhddADAM15對B16細胞體外增殖、遷移、侵襲和細胞周期等行為的影響，并初步檢測了rhddADAM15作用引起的B16細胞中p38MAPK激酶活性的變化，對rhddADAM15的作用機制進行了初步探討。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑和細胞株 重組人rhddADAM15由本實驗室制備，RPMI 1640培養基購自Gibco公司，MCDB-131培養基、牛血清白蛋白(BSA)、青霉素和鏈霉素等均購自Sigma公司，噻唑蘭(MTT)購自Biomol公司，Matrigel基質蛋白購自BD公司，侵襲小室Millicell購自Millipore公司，胰酶、碘化丙啶(PI)和RNA酶A均購自凱基生物公司，半胱天冬酶(caspase)-9抑制劑Z-LEHD-FMK、caspase活力檢測試劑盒購自Santa Cruz Biotechnology公司。小鼠黑色素瘤細胞(B16)購自中科院細胞庫，保存于液氮罐中。人微血管內皮細胞(HMEC-1)由法國國家衛生醫藥研究院U553研究所(INSERM U553)陸核教授饋贈，保存于液氮罐中。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 B16細胞采用含10%小牛血清的RPMI 1640培養基(1×105U·L-1的青霉素和100 mg·L-1鏈霉素)，37℃，5%CO2培養箱中常規培養。培養至所需細胞量時，傾去培養液，加入5 ml 0.25%胰酶溶液消化，37℃保溫至細胞開始從瓶壁脫落前，傾去胰酶溶液，加入適量以上培養基，用玻璃吸管吹打至細胞全部從瓶壁脫落;血球計數板計數細胞，用培養基稀釋細胞濃度至0.8×108～1.0×108·L-1;鋪于96孔細胞培養板，每孔加100 μl細胞懸液，37℃，5%CO2培養箱中常規培養24 h后備用。HMEC-1細胞采用含10%小牛血清的MCDB-131 培養基(含 10 μg·L-1EGF，1 mg·L-1氫化可的松)，37℃，5%CO2培養箱中常規培養，同上常規培養及處理

1.2.2 MTT法測定rhddADAM15對細胞增殖的抑制 將rhddADAM15以培養基稀釋至系列濃度(0、2.5、5、7.5、10、12.5 和 15 mg·L-1)，加入培養至24 h的96孔細胞培養板，每濃度點設4個復孔，同時設置空白孔及陰性對照孔，每實驗孔均以培養基補至300 μl，培養24 h;小心吸去上清液，每孔加入180 μl新鮮培養基，再加 20 μl MTT 溶液(5 g·L-1，即0.5%MTT)，繼續培養4 h;終止培養，小心吸去孔內培養液;每孔加入150 μl DMSO，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀570 nm處測量各孔的吸光值(A570nm)。按以下公式計算平均抑制率:抑制率/%=(1-給藥組A570nm/對照組A570nm)×100%。繪制不同加藥濃度下的細胞生長抑制曲線，計算藥物對細胞的半數抑制濃度IC50(抑制率為50%時藥物的濃度)。

1.2.3 細胞遷移試驗 采用劃痕實驗檢測rhdd-ADAM15對B16細胞遷移的影響［7］，無血清培養液培養細胞24 h使細胞生長同步化，再轉入全培養液培養細胞至對數生長期時，胰酶消化，24孔培養板每孔加入細胞5×105個，培養24 h，用無菌槍頭沿孔中心劃出約1 mm寬“傷痕”，PBS沖洗干凈，加入培養液稀釋的不同濃度的rhddADAM15(0、5、7.5和10 mg·L-1)，每隔12 h觀察兩邊細胞向中間遷移的情況并拍照。

1.2.4 細胞侵襲試驗 采用經典的Albini侵襲小室檢測rhddADAM15對 B16細胞體外侵襲的影響［8］:在4℃融解Matrigel基質蛋白膠，鋪于 millicell侵襲小室上下室之間的聚碳酸酯微孔膜上，備用。8%的胎牛血清(FBS)，置入侵襲小室的下室作為趨化因子液。細胞培養至對數生長期時，消化離心，PBS洗3次，臺盼藍染色檢測細胞活力95%以上，用含有不同濃度的 rhddADAM15(0、2.5、5、7.5 和10 mg·L-1)培養液稀釋細胞至5×108·L-1，每個侵襲小室上室中加入含不同濃度rhddADAM15的細胞懸液200 μl(105個細胞)，置于培養箱中培養12 h，取下微孔膜，用乙醇棉球擦盡上表面細胞后，甲醛固定，蘇木精染色。顯微鏡下觀察穿入膜內細胞，計數中間及四周5個高倍(400倍)鏡下視野細胞數，計算平均數。每組細胞5個樣本，計算平均數進行比較。

1.2.5 rhddADAM15對細胞周期分布的影響 分別收集不同濃度rhddADAM15藥物組(0、5、7.5和10 mg·L-1)和空白對照組培養24 h后的B16細胞，移至10 mL的錐形管中，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清。PBS洗滌2次，用500 μl的PBS重懸細胞。臺盼藍染色檢測細胞活力。然后加入5 ml 70%冷乙醇4℃固定過夜。1 000 r·min-1離心5 min，棄乙醇。旋攪沉淀，用5 ml PBS+1%小牛血清清洗2次。用含1%小牛血清的800 μl PBS重懸細胞沉淀。加200 μl PI染色液和RNA酶A37℃避光孵育30 min。流式細胞儀檢測，每次計數105個細胞，用Cell Quest采集數據，ModFit LT3.0軟件分析細胞周期及凋亡峰。

1.2.6 Caspase酶活力測定 將細胞培養至對數生長期，加入rhddADAM15使終濃度為7.5 mg·L-1分別于0、12、24和36 h收集細胞。按照試劑盒提供方法測定caspase酶活力。

1.2.7 Caspase-9抑制劑對rhddADAM15抑制細胞生長的影響 按“1.2.1”方法培養細胞，加入終濃度為12 μmol·L-1的Z-LEHD-FMK共培養2 h后，加入rhddADAM15使終濃度為0、5、7.5和10 mg·L-1，繼續培養24 h，按1.2.2方法測定抑制率。

1.2.8 B16細胞p38 MAPK激酶活性測定

1.2.8.1 制備B16細胞裂解液 B16細胞同步化后培養至對數生長期，培養液中加入rhddADAM15至不同終濃度 (0、5、7.5和10 mg·L-1)，繼續培養24 h后，EDTA消化，收集大量B16細胞，PBS洗滌細胞數次，加入4℃預冷的細胞裂解緩沖液(1%Triton X-100，1%NP-40，0.125 mol·L-1EDTA，0.1 mmol·L-1PMSF，150 mmol·L-1NaCl，25 mmol·L-1Tris-Cl，pH 7.4，0.1%完全蛋白酶抑制劑)，冰浴下將細胞與玻璃珠懸浮混勻，劇烈振蕩，重復數次，靜置30 min，離心(4℃ ，12 00 r·min-1，20 min)，收集上清混合蛋白質溶液，備用。

1.2.8.2 p38MAPK激酶活性測定 Bradford法測定蛋白濃度，各取蛋白40 μg變性，SDS-PAGE電泳后電轉移至硝酸纖維素膜(NC膜)，TBST緩沖液(5%脫脂奶粉)封閉1 h。NC膜分別與p-p38單克隆抗體(1∶1 000)或兔抗p38MAPK多克隆抗體(1∶1 000)4℃下孵育過夜，TBST洗滌4次，加入相應的二抗37℃孵育2 h，TBST洗滌3次，加入DAB顯色液顯色，薄層掃描儀測定印跡區帶的光密度值，每組實驗重復3次。

1.2.9 數據處理 用SPSS13.0統計軟件進行分析，兩樣本均數比較用t檢驗，細胞抑制試驗重復3次以上，生長抑制率與藥物濃度的關系用直線回歸與相關分析，細胞侵襲和遷移試驗、細胞周期檢測和p38MAPK激酶活性試驗重復2次以上，分別拍照或測定相關值。

2 結果

2.1 rhddADAM15抑制腫瘤細胞及內皮細胞的生長 MTT法檢測顯示rhddADAM15可以體外抑制內皮細胞HEMC-1和腫瘤細胞B16的生長，抑制作用隨著rhddADAM15濃度的增加而增強，呈現濃度依賴性，IC50分別為18.02和13.80 mg·L-1。另一方面，當rhddADAM15濃度為7.5 mg·L-1時，rhdd-ADAM15對 B16細胞的抑制率比 HMEC-1高出81.3%(P＜0.01)。這一結果表明，同一濃度的rhddADAM15對腫瘤細胞生長的抑制作用強于內皮細胞，差異具有顯著性，從而證實了rhddADAM15具有體外抑制腫瘤細胞增殖的生物功能。為排除rhdd-ADAM15對B16細胞遷移和侵襲的作用是由于細胞活力受抑制引起的，實驗中采用的藥物濃度是2.5、5、7.5 和 10 mg·L-1。

Fig 1 Curves of the inhibitory rate of rhddADAM15 on HMEC-1 and B16 cells(24 h，n=4)

2.2 rhddADAM15抑制B16細胞的侵襲和遷移

Albini侵襲小室實驗結果表明rhddADAM15可明顯抑制B16細胞對Matrigel基質膠的破壞作用，從而阻止細胞的侵襲，隨著rhddADAM15濃度的增加，進入微孔膜中的細胞數量明顯下降，當rhddADAM15濃度為7.5和10 mg·L-1時，與對照組(未添加rhddADAM15)比較，侵襲細胞數量分別下降了0.55和0.87。另一方面，劃痕實驗表明rhddADAM15對B16細胞遷移也有明顯抑制作用。rhddADAM15(7.5 mg·L-1)與B16細胞共培養12和24 h時，與對照組比較，對細胞遷移的抑制作用與時間成正比。

Fig 2 Inhibitory effect of rhddADAM15 on the invasion of B16 cells(12 h，n=5)

Fig 3 Inhibitory effect of rhddADAM15(7.5 mg·L－1)on the migration of B16 cells(×40).(n=3)

2.3 rhddADAM15對B16的細胞周期的影響 如Tab 1所示，與對照組相比，rhddADAM15作用使得S期細胞數量減少，G2/M期細胞的數量增加，而且這種影響呈現出濃度依賴型，但在實驗結果中的凋亡現象并不明顯。

Tab1 Effect of rhddADAM15 on B16 cell cycle distribution(±s，n=4)

Tab1 Effect of rhddADAM15 on B16 cell cycle distribution(±s，n=4)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control

rhddADAM15/mg·L-1 Cell cycle distribution/%G0/G1 S G2/M Control 60.67±12.31 29.39±6.43 9.94±2.32 5 63.24±9.41* 20.45±4.33* 16.31±4.29*7.5 67.46±17.14* 9.43±2.50* 23.11±5.20*10 66.83±15.46＊＊ 4.40±1.09＊＊28.77±5.87＊＊

2.4 rhddADAM15對B16細胞中Caspase酶活力的影響及caspase-9抑制劑對rhddADAM15作用的干擾 如Tab 2所示:rhddADAM15在濃度為7.5 mg·L-1時對B16細胞中caspase-3和 caspase-9酶活力的影響并不明顯，只是在作用36 h后有一定升高。另外，caspase-9抑制劑可部分降低 rhddADAM15對細胞生長的抑制作用，與未添加caspase-9抑制劑的對照組相比，rhddADAM15(5、7.5和10 mg·L-1)作用抑制率分別降低了1.6%、2.3%和5.1%(P＜0.05)。

Tab 2Effect of rhddADAM15 on caspases in B16 cells(±s，n=4)

Tab 2Effect of rhddADAM15 on caspases in B16 cells(±s，n=4)

*P＜0.05 vs control

Time/h Enzyme activity/U caspase-3 caspase-9 0 2.54±0.67 0.19±0.03 12 2.30±0.41 0.25±0.04 24 3.27±0.64 0.29±0.05 36 5.83±0.46* 0.50±0.07*

2.5 rhddADAM15對B16細胞中p38激酶活性的影響 Western blot結果如Fig 4所示:p-p38表示被激活的p38激酶，隨著rhddADAM15濃度的不斷增加，p38激酶磷酸化水平不斷增高，p-p38/p38的比例升高，當rhddADAM15為10 mg·L-1時，p38激酶的磷酸化程度達0.80，但總的p38激酶表達水平并不隨rhddADAM15濃度的增加而增加，對照組p38激酶磷酸化不明顯。

3 討論

腫瘤細胞轉移包括腫瘤生長侵襲、細胞脫落進入循環流動、與脈管內皮或組織基質黏附、通過組織和間隙變形移動、降解破壞細胞間質和定植生長等主要過程。侵襲轉移是腫瘤惡性程度的重要生物學特性和影響腫瘤預后的主要因素，因此對侵襲轉移機制的深入研究對腫瘤治療方案的選擇和判斷預后具有重要的意義。已有研究表明，rhddADAM15具有抑制乳腺癌MDA-MB-231腫瘤細胞生長和腫瘤新生血管形成的功能，對接種B16腫瘤小鼠的肺轉移具有明顯的抑制作用［4］，還可以通過與細胞表面整合素α5β1的相互作用抑制細胞轉移［9］。本研究結果發現rhddADAM15對B16細胞體外增殖表現出明顯的抑制作用，并呈濃度依賴性抑制細胞侵襲，時間依賴性抑制細胞遷移，這與文獻報道的結果一致，其抑制腫瘤細胞侵襲轉移的機制可能與影響細胞間相互識別以及細胞與細胞基質之間的相互作用有關。

Fig 4 p38 activation in B16 cells incluced by rhddADM15(24 h，n=3).*P＜0.05 vs control(0 mg·L-1)

腫瘤細胞最基本的特征是細胞平衡機制失衡。細胞不受控制地異常增殖，而失控性增殖的根本原因就在于細胞周期的監控機制——細胞周期檢查點被破壞，導致細胞增殖、分化和死亡機制的紊亂，因此，選擇能同時破壞細胞并引起凋亡的藥物，以調節細胞周期將是今后高效治療腫瘤的新策略［10］。在研究rhddADAM15作用對細胞周期影響時發現，rhddADAM15主要是將B16細胞阻滯在G2/M期，從而延緩細胞生長速度，使得細胞體外增殖受到明顯抑制，但沒有發現直接證據表明rhddADAM15能夠促使B16細胞產生壞死或凋亡的現象，提示rhdd-ADAM15對B16細胞生長的抑制作用可能不是通過直接誘導細胞凋亡實現的。進一步研究rhddADAM15對細胞凋亡的主要執行蛋白caspase蛋白酶活力的影響，發現隨著作用時間的延長(36 h)，caspase酶活性有一定提高，但不明顯，同時caspase酶抑制劑可以部分降低較高濃度rhddADAM15(10 mg·L-1)對 B16細胞生長的抑制作用，提示caspase信號通路可能參與了rhddADAM15誘導的B16細胞死亡，但具體作用方式還有待深入研究。Trochon-Joseph等［4］研究重組表達的 ADAM15去整合素蛋白片段(RDD)對牛肺動脈內皮細胞(CPAE)凋亡的影響時，也發現該蛋白對誘導細胞凋亡現象不明顯;B?hm等［11］則報道 ADAM15對骨關節炎軟骨細胞具有抗凋亡作用，與本文的結果相似。

真核細胞中，絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路擔負著將胞外各種有絲分裂和應急信號傳遞至胞核，并調節基因表達的重要使命，在細胞惡變和腫瘤發生中起著重要的調控作用。通過調節不同MAPK通路的活性可控制細胞的存活與死亡。p38信號通路是MAPK通路的重要分支，已有研究表明，p38通路在調控細胞生長、激活G2期檢測點、引起G2/M期阻滯中發揮重要作用:Afrasiabi等［12］研究神經鞘氨醇磷酸膽堿(sphingosylphosphorylcholine，SPC)抑制甲狀腺癌細胞的增殖和遷移時發現，隨著G2/M的細胞數量明顯增加，MAPK信號通路成員的磷酸化水平明顯降低，表明SPC的抑制作用是通過調節MAPK信號通路來實現的;然而，關于ADAM15與p38信號通路相關性的報道則很少:ADAM15通過抑制Erk通路引起細胞表面整合素α5β1聚集而抑制細胞的轉移和侵襲，通過調節Src/ERK1/2 信號通路調控中性粒細胞遷移信號［9，13］;另一方面，p38蛋白激酶級聯的信號傳遞是通過蛋白質的磷酸化來完成的。如脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)對血管內皮細胞的p38MAPK的激活是通過一種有序的激酶級聯(MAPKKK→MAPKK→MAPK)而實現的。改變蛋白激酶信號分子的某個(些)氨基酸，會影響其三維結構，從而激活或抑制信號分子的生物學活性。在本研究結果中，rhddADAM15作用使p38激酶磷酸化而激活，隨著rhddADAM15濃度的提高，p38激酶磷酸化程度加強，活性增強，提示p38MAPK信號通路可能參與了rhddADAM15調控B16細胞行為的過程。但是 rhddADAM15激活p38信號通路的級聯激活過程還有待后續研究中進一步闡明，同時在上述實驗結果的基礎上，我們還將繼續研究rhddADAM15調控p38MAPK信號通路的機制，如p38激酶特異性抑制劑的阻斷是否影響rhddADAM15對B16細胞行為的調控等。

［1］Lucas N，Najy A J，Day M L.The therapeutic potential of ADAM15［J］.Curr Pharm Des，2009，15(20):2311-8.

［2］Lucas N，Day M L.The role of the disintegrin metalloproteinase ADAM15 in prostate cancer progression［J］.J Cell Biochem，2009，106(6):967-74.

［3］Ungerer C，Doberstein K，Bürger C，et al.ADAM15 expression is downregulated in melanoma metastasis compared to primary melanoma［J］.Biochem Biophys Res Commun，2010，401(3):363-9.

［4］Trochon-Joseph V，Martel-Renoir D，Mir L M，et al.Evidence of antiangiogenic and antimetastatic activities of the recombinant disintegrin domain of metargidin［J］.Cancer Res，2004，64(6):2062-9.

［5］林 菁，彭華毅.黃癸素誘導小鼠黑色素瘤B16細胞凋亡的研究［J］.中國藥理學通報，2010，26(12):1630-4.

［5］Lin J，Peng H Y.Apoptosis of B16 melanoma cells induced by berberine α-hydroxy-β-decanoylethyl sulfonate［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(12):1630-4.

［6］Wu J，Zhang L，Lei J，et al.Enhancement of recombinant human ADAM15 disintegrin domain expression level by releasing the rare codons and amino acids restriction［J］.Appl Biochem Biotechnol，2009，157(2):299-310.

［7］Hwang E S，Kim G H.Allyl isothiocyanate influencesin vitroinvasion，adhesion and gene expression in SK-Hep1 cells［J］.J Nutr Biochem，2006，231(23):421-30.

［8］Albini A，Iwamoto Y，Kleinman H K，et al.A rapidin vitroassay for quantitating the invasive potential of tumor cells［J］.Cancer Res，1987，47(12):3239-45.

［9］Chen Q，Meng L H，Zhu C H，et al.ADAM15 suppresses cell motility by driving integrin alpha 5 beta1 cell surface expression via Erk inactivation［J］.Int J Biochem Cell Biol，2008，40(10):2164-73.

［10］Kastan M B，Bartek J.Cell-cycle checkpoints and cancer［J］.Nature，2004，432(12):316-23.

［11］B?hm B，Hess S，Krause K，et al.ADAM15 exerts an antiapoptotic effect on osteoarthritic chondrocytes via up-regulation of the X-linked inhibitor of apoptosis［J］.Arthritis Rheum，2010，62(5):1372-82.

［12］Afrasiabi E，Blom T，Balthasar S，et al.Antiproliferative effect of sphingosylphosphorylcholine in thyroid FRO cancer cells mediated by cell cycle arrest in the G2/M phase［J］.Mol Cell Endocrinol，2007，274(1-2):43-5.

［13］Sun C，Wu M H，Guo M，et al.ADAM15 regulates endothelial permeability and neutrophil migration via Src/ERK1/2 signalling［J］.Cardiovasc Res，2010，87(2):348-55.