紋狀體內(nèi)單側(cè)注射6-羥多巴制備小鼠帕金森病模型

付愛玲，王逸麟

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一種臨床常見的神經(jīng)退行性疾病。PD的病理特征主要是中腦黑質(zhì)致密部，出現(xiàn)明顯的多巴胺神經(jīng)元缺失，導(dǎo)致其靶組織紋狀體內(nèi)多巴胺水平降低，從而引起運(yùn)動(dòng)失調(diào)和認(rèn)知功能障礙。

在嚙齒類動(dòng)物模型中，大鼠前腦內(nèi)側(cè)束(median forebrain bundle，MFB)內(nèi)單側(cè)注射 6-羥多巴(6-hydroxydopamine，6-OHDA)制備的PD模型得到了廣泛的應(yīng)用［1］。然而，這個(gè)模型存在的主要問題是成功率較低，平均30% ～40%。小鼠腹腔注射神經(jīng)毒素 1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP)也用以制備PD模型［2］，但MPTP注射引起的是雙側(cè)PD癥狀，不能進(jìn)行基于一側(cè)損傷所產(chǎn)生的行為學(xué)檢測(cè)［3］。6-OHDA能夠選擇性地破壞兒茶酚胺類神經(jīng)元，單側(cè)腦內(nèi)注射后，通過檢測(cè)單側(cè)偏倚，易于評(píng)估運(yùn)動(dòng)損傷［4］。另外，6-OHDA能夠阻斷腦內(nèi)的黑質(zhì)紋狀體通路，導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元的退化，在較長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)可產(chǎn)生穩(wěn)定的運(yùn)動(dòng)損傷，有利于篩選有效藥物［5］。

至今在國(guó)內(nèi)尚未見小鼠6-OHDA腦內(nèi)注射制備PD模型的報(bào)道。可能的原因是小鼠MFB區(qū)域較小，難以進(jìn)行局部腦內(nèi)注射。本研究中，我們將6-OHDA單側(cè)注射入小鼠腦區(qū)面積較大的紋狀體內(nèi)，使用與大鼠PD模型相同的方法進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè)和生化指標(biāo)測(cè)定，并與大鼠PD模型進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，小鼠6-OHDA單側(cè)紋狀體內(nèi)注射可成功制作急性PD模型，成功率為95%，持續(xù)時(shí)間大約4周。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與試劑 健康♂SD大鼠(200～250 g)和C57BL/6小鼠(25～30 g)，重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供。6-羥多巴氫溴酸(6-hydroxydopamine hydrobromide，6-OHDA·HBr)、阿樸嗎啡、安非他命、NADPH、四氫葉酸、過氧化氫酶、Fe(NH4)2(SO4)2和L-酪氨酸均購(gòu)自Sigma公司。3H-L-酪氨酸和Ultima gold閃爍液購(gòu)自Perkin Elmer公司。其他試劑均為分析純。6-OHDA·HBr臨用前溶解在0.02%抗壞血酸溶液中，終濃度為3 g·L-1。

1.2 小鼠單側(cè)紋狀體內(nèi)注射6-OHDA制備PD模型 小鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉(0.01 ml·g-1)。將動(dòng)物固定在立體定位儀上，沿顱頂正中矢切開皮膚，脫脂棉輕輕搽拭暴露前囟(Bregma)。在前囟后1.0 mm、中線旁2.1 mm，以及前囟后0.3 mm、中線旁2.3 mm處打孔。分別用微量進(jìn)樣器緩慢注入6-OHDA·HBr溶液2 μl(顱骨下2.9 mm)，注射后留針1 min，退出進(jìn)樣器，縫合處理創(chuàng)面。

1.3 大鼠PD模型的制備 將大鼠預(yù)先腹腔注射去甲丙咪嗪(25 μg·g-1)。然后腹腔注射水合氯醛麻醉后，將動(dòng)物固定于腦立體定位儀。沿顱頂正中矢切開皮膚，3%過氧化氫溶液去除皮下粘膜。于前囟后-4.0 mm、中線旁1.6 mm處開顱。微量進(jìn)樣器插入左側(cè)前腦內(nèi)側(cè)束。在給予去甲丙咪嗪30min后，微量進(jìn)樣器注射入6-OHDA溶液4 μl(顱骨下8.0 mm)，注射速度為0.5 μl·min-1。注射后留針8min后緩慢退出進(jìn)樣器，縫合創(chuàng)面。

1.4 動(dòng)物行為測(cè)試 在手術(shù)后的1～5周，腹腔注射1 μg·g-1阿樸嗎啡(0.5 g·L-1)，將動(dòng)物放于40 cm直徑的圓底鍋內(nèi)，計(jì)數(shù)20 min內(nèi)動(dòng)物向給藥對(duì)側(cè)旋轉(zhuǎn)的圈數(shù)(旋轉(zhuǎn)360度計(jì)為一圈)。在給予阿樸嗎啡的d 1，腹腔注射2.5 μg·g-1的安非他命(0.5 g·L-1)，計(jì)算20 min內(nèi)動(dòng)物向給藥側(cè)旋轉(zhuǎn)的圈數(shù)。旋轉(zhuǎn)次數(shù)以每分鐘圈數(shù)(rotation·min-1)表示。

1.5 酪氨酸羥化酶活性測(cè)定 采用同位素法進(jìn)行測(cè)定動(dòng)物皮層和紋狀體內(nèi)酪氨酸羥化酶的活性［6］。脫臼處死小鼠，取出大腦，快速分離皮層、左右側(cè)紋狀體。測(cè)定時(shí)按照1∶10的比例加入磷酸緩沖液，冰浴中勻漿。于200 μl勻漿液中加入100 μl反應(yīng)液(磷酸緩沖液中含有11.8 g·L-1NADPH，7.6 g·L-1四氫葉酸，233 g·L-1過氧化氫酶，10 mmol·L-1Fe(NH4)2(SO4)2，1.5 mmol·L-1L-酪氨酸，5.18 × 105Bq3H-L-酪氨酸)。混勻后在37℃ 孵育30 min，加入1.0 ml的7.5%活性碳終止反應(yīng)。離心，吸取200 μl上清液，轉(zhuǎn)移到液閃瓶中，加入10 ml Ultima gold閃爍液，混勻，于液閃計(jì)數(shù)器上進(jìn)行測(cè)定。勻漿液蛋白含量用Lowry法測(cè)定。酪氨酸羥化酶活性以nmol·h-1·g-1Pro表示。

2 結(jié)果

實(shí)驗(yàn)共使用了20只C57/BL小鼠和20只SD大鼠。小鼠手術(shù)后有1只在1周內(nèi)死亡，總成功率為95%;SD大鼠，9只未成功，2只大鼠手術(shù)后1周內(nèi)死亡，成功率為45%。

2.1 阿樸嗎啡誘發(fā)的旋轉(zhuǎn) 大鼠給予6-OHDA后1周，動(dòng)物開始出現(xiàn)旋轉(zhuǎn)行為，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，旋轉(zhuǎn)次數(shù)逐漸增多。一般認(rèn)為，平均每分鐘旋轉(zhuǎn)7次以上者，被認(rèn)為是成功的PD模型。小鼠注射6-OHDA后也出現(xiàn)了明顯的旋轉(zhuǎn)行為，第2周時(shí)，平均每分鐘旋轉(zhuǎn)次數(shù)已達(dá)到9次以上(9.9±1.0)，但第3周后，次數(shù)開始下降，至第5周下降至7.5次(7.5±0.9)(Fig 1)。這個(gè)結(jié)果表明，小鼠注射6-OHDA制備的PD模型能夠持續(xù)4周左右，可用作PD的急性模型。

Fig 1 Comparison of apomorphine-induced rotation between rats and mice

2.2 安非他命誘發(fā)的旋轉(zhuǎn) 安非他命誘發(fā)動(dòng)物旋轉(zhuǎn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與阿樸嗎啡相似。小鼠注射6-OHDA第2周，旋轉(zhuǎn)次數(shù)已達(dá)到7次以上，第3周時(shí)開始下降，至第5周時(shí)下降至5.1次(Fig 2)。這個(gè)結(jié)果確定，小鼠注射6-OHDA制備的PD急性模型是穩(wěn)定的，對(duì)不同的所試藥物均可出現(xiàn)相應(yīng)的反應(yīng)。

Fig 2 Comparison of amphetamine-induced rotation between rats and mice

2.3 皮層和紋狀體內(nèi)TH活性的測(cè)定 結(jié)果顯示，大鼠左側(cè)(未注射側(cè))紋狀體內(nèi)TH活性正常，而注射側(cè)TH活性明顯降低。這與文獻(xiàn)報(bào)道一致［7］。小鼠注射6-OHDA后，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與大鼠相似(Fig 3)。表明小鼠單側(cè)紋狀體內(nèi)注射6-OHDA后，可引起了多巴能神經(jīng)元損傷，導(dǎo)致TH活性下降。

3 討論

大鼠MFB內(nèi)注射6-OHDA是常用的PD模型。但該模型成功率較低。原因可能是MFB區(qū)域比較狹窄，對(duì)操作的要求非常嚴(yán)格。6-OHDA單側(cè)損毀制備PD模型的優(yōu)勢(shì)在于旋轉(zhuǎn)癥狀可以量化，容易評(píng)價(jià)抗PD藥物和治療方法的療效。

在一些藥物研究中，使用小鼠比大鼠更加有利，因此我們選擇小鼠進(jìn)行PD模型實(shí)驗(yàn)。結(jié)果證明，小鼠注射6-OHDA制備的PD模型能夠持續(xù)4周左右，可用作急性模型。該模型是穩(wěn)定、有效，對(duì)不同的所試藥物可出現(xiàn)相應(yīng)的反應(yīng)。推測(cè)國(guó)內(nèi)常用的昆明種小鼠，也可能會(huì)出現(xiàn)相似的結(jié)果。

Fig 3 Measurement of TH activity in cortex，left and right striatum*P＜0.05 vs respective left striatum.

TH是兒茶酚胺類活性物質(zhì)生物合成的限速酶，它的活性可作為多巴能神經(jīng)元的指標(biāo)［8］。本實(shí)驗(yàn)中，我們采用同位素法檢測(cè)大鼠和小鼠皮層、左右紋狀體內(nèi)TH活性。結(jié)果表明，動(dòng)物注射6-OHDA后，對(duì)皮層和非注射側(cè)的紋狀體內(nèi)的TH活性沒有影響，而注射側(cè)的TH活性明顯下降，說明動(dòng)物的行為變化與TH活性下降有關(guān)。

總之，本文介紹的小鼠PD模型簡(jiǎn)單易行、成功率高，并且可出現(xiàn)與大鼠PD模型相似的行為學(xué)特征和生化指標(biāo)的變化。以上結(jié)果證明，小鼠6-OHDA單側(cè)紋狀體內(nèi)注射可用于制作急性PD模型。

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