酶法水解乳清蛋白工藝研究

呂志平，肖詩英，海文英

（1.蒙牛乳業（集團）股份有限責任公司，內蒙古 呼和浩特 011500；2.湖北工業大學化學與環境工程學院，湖北 武漢 430068）

酶法水解乳清蛋白工藝研究

呂志平1，肖詩英2，海文英2

（1.蒙牛乳業（集團）股份有限責任公司，內蒙古 呼和浩特 011500；2.湖北工業大學化學與環境工程學院，湖北 武漢 430068）

以乳清蛋白為原料，選擇堿性蛋白酶水解乳清蛋白。通過四因素三水平正交試驗設計方法對堿性蛋白酶水解乳清蛋白的工藝條件[酶-底濃度比（E/S），pH，水解溫度，水解時間]進行優化，確定了堿性蛋白酶酶解乳清蛋白的最佳水解條件為酶-底濃度比0.05，pH 8.0，反應溫度60℃，水解200 min，此條件下水解度為21.92%。各因素對水解度的影響主次順序為酶-底濃度比（E/S）＞水解溫度＞水解時間＞pH。

乳清蛋白；酶解；水解度

乳清蛋白（whey protein，WP）是乳清中多種蛋白質組分的統稱，一般是指來自牛乳的乳清蛋白，牛乳中乳清蛋白約占總蛋白含量的20%左右，由β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、血清白蛋白、免疫球蛋白、乳鐵蛋白、乳過氧化物酶以及多種生物活性因子等組成。提取蛋白的加工過程不同，便可得到不同蛋白組成的乳清蛋白產品，濃縮乳清蛋白（concentrated whey protein,WPC）是蛋白含量為25%～28%的商業產品，而分離乳清蛋白（isolated whey protein，WPI）的蛋白質含量通常大于90%[1]。乳清蛋白屬于全價蛋白質，易于消化吸收，具有很高的營養價值，廣泛應用于嬰幼兒配方食品中。乳清蛋白經適度改性可以進一步提高或改善其功能特性，擴大在食品中的應用，對乳清的有效利用具有重要意義。乳清蛋白的改性方法有物理、化學和酶法改性，通過改變乳清蛋白的分子量的大小、氨基酸的組成和順序、結構、表面靜電荷以及疏水基團等，可以達到增強或改善其功能特性的目的。酶法改性還可以降低牛乳清蛋白的免疫原性，減少嬰幼兒的過敏反應[2]。酶促反應的條件比化學反應要溫和，也降低了改變食品的色澤、質地、營養和安全性的副反應。對乳清蛋白的酶法改性常用的是胃蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶和堿性蛋白酶等酶法水解，還有利用轉谷氨酰胺酶對蛋白質進行交聯。本文就堿性蛋白酶（Alcalase）酶法水解乳清蛋白的最佳條件進行研究。

1 材料和設備

1.1 材料

脫鹽乳清粉：龍丹乳業集團提供，愛爾蘭產；堿性蛋白酶：北京諾和諾德生物制劑有限公司提供。

1.2 試劑

茚三酮顯色液：4 g茚三酮加入200 mL蒸餾水，溶解，放棕色瓶中保存，應每次使用前配制。

pH8緩沖溶液：0.2 mol Na2HPO494.7 mL與0.2 mol NaH2PO45.3 mL混合。

其他試劑見有關參考文獻[3]。

1.3 儀器

Phs-3C精密pH計：上海興華電子儀器廠；電動攪拌器J-1型：常州國華電器有限公司；電熱恒溫干燥箱HG202-5：南京實驗儀器廠；電熱恒溫水浴鍋S21-4：上海醫療器械五廠；分析天平：沈陽龍騰電子稱量儀器有限公司；751分光光度計：上海第三分析儀器廠。

2 方法

2.1 乳清蛋白水解工藝流程

乳清粉→復原（10%）→沸水浴加熱15 min→降至所需溫度，水浴→用NaOH調pH→加酶水解→加熱鈍化酶→測水解度→備用

制備質量分數為10%的乳清蛋白溶液，在80℃下振蕩水浴加熱15 min，調節其pH，降至所需溫度，加入一定量的酶，在恒溫水浴鍋攪拌中進行水解。水解結束后，將反應體系置于沸水浴中加熱10 min，使酶失活。

2.2 蛋白水解液水解度的測定

常用的測定蛋白質水解度的方法有很多，常用的方法有三氯乙酸沉淀法，三硝基苯磺酸法[4]，甲醛滴定法，pH-stat法[5]等，本論文采用的是茚三酮比色法[3]。

2.2.1 工作曲線的繪制

取水解液0.1 mL～1.0 mL到25 mL比色管中，用蒸餾水稀釋至4.0 mL，加pH8緩沖溶液1.0 mL，茚三酮溶液1.0 mL，均勻混合，沸水浴加熱15 min，冷卻，蒸餾水稀釋至25 mL。在570 nm處測光密度（水作參比）。另取100 mg蛋白，加蒸餾水100 mL，振蕩均勻后過濾，取相應體積的濾液，按上述方法測得光密度值。以相同體積樣品的光密度之差和蛋白質量繪制工作曲線，再取線性部分作標準曲線。

2.2.2 水解液水解度的測定

取水解后滅酶的水解液1 mL，稀釋至100 mL，過濾，取濾液1 mL～4 mL（使測定值在工作曲線的線性部分），加水至4 mL，加pH8緩沖溶液1.0 mL，茚三酮溶液1.0mL，水浴加熱15min，冷卻，再用蒸餾水稀釋至25 mL，在570 nm處測光密度（水作參比）。另取相同濃度未水解蛋白溶液1 mL～4 mL測光密度，以二者光密度之差從工作曲線上查蛋白質含量，按下式計算水解度：

式中：A為查表得蛋白質的質量，mg；W為樣品質量，g；V1為水解液的總體積，mL；V2為顯色時所用稀釋液的體積，mL。

2.3 正交試驗設計

影響乳清蛋白水解主要因素是酶-底濃度比（E/S），水解反應溫度（℃），pH和水解時間（min）[6]，以水解度（DH%）為指標，采用四因素三水平的正交表L9（34）。

正交試驗因素見表1。

表 1 正交試驗因素水平表Table 1 Factor level of orthogonal experiment on extraction

3 結果和討論

正交試驗結果見表2。

表 2 正交試驗結果Table 2 The results of orthogonal experiment

分析表2，實驗結果表明：堿性蛋白酶水解乳清蛋白最佳條件為：A1B1C3D3，即酶-底濃度比（E/S）=0.05，水解溫度T=50℃，pH=8.0，水解時間t=200 min，因表中沒有這組條件，因此需在該條件下進行實驗，并與第3組實驗結果進行對比，取水解度較高的一組來確定最佳實驗條件。經驗證得該條件下水解度為20.80%，低于第3組實驗結果21.92%，因此確定最佳實驗條件應為第3組實驗條件，即A1B3C3D3，此時的酶-底濃度比（E/S）=0.05，水解溫度T=60℃，pH=8.0，水解時間t=200 min。

通過極差分析得知，各因素對水解度的影響主次順序為：A＞B＞D＞C，即酶-底濃度比（E/S）＞水解溫度值＞水解時間＞pH。

4 結論

堿性蛋白酶（Alcalase）酶解乳清蛋白的最佳工藝條件為：酶-底濃度比（E/S）為0.05，水解溫度為60℃，pH為8.0，水解時間為200min，在此條件下水解度為21.92%。

[1]趙晶，張睿.乳清蛋白酶的改性研究[J].包裝與食品機械，2003，21(6)：9-12

[2]高金明，葛珊.乳清蛋白改性的研究進展[J].食品工業科技，2009，30(7)：382-384

[3]郭興鳳.蛋白質水解度的測定[J].中國油脂，2000，25(6)：176-179

[4]鄭海.復合酶法水解乳清蛋白過敏原的研究[C].北京：中國農業大學碩士學位論文，2009

[5]Adler-Nissen J.Determination of the degree of hydrolysis of food protein hydrolysates by trinitrobenzenesulfonic acid[J].J Agric Food Chem，1999，27(9)：1256-1262

[6]張俊英，王彩云，靳燁，等.酶水解乳清蛋白工藝條件的研究[J].農產品加工學刊，2009，6(3)：35-38

Study on Enzymatic Hydrolysis of Whey Protein Process

Lü Zhi-ping1，XIAO Shi-ying2，HAI Wen-ying2
（1.Inner Mongolia Mengniu Dairy（Group）Co.，Ltd.，Hohhot 011500，Inner Mongolia，China；2.Hubei University of Technology School of Chemical and Environmental Engineering，Wuhan 430068，Hubei，China）

We chose whey protein as the raw material and selected alkaline protease（Alcalase）to hydrolyze whey protein.Through the four factors and three levels orthogonal experimental designed method（enzyme and substrate ratio（E/S），pH values，hydrolysis temperature，hydrolysis time）to optimize whey protein hydrolysis process conditions.Determined the alkaline protease（Alcalase）enzymatic hydrolysis of whey protein optimum conditions were enzyme and substrate concentration ratio 0.05，pH 8.0，reaction temperature 60 ℃，hydrolysis 200 min.Under these conditions，the degree of hydrolysis was 21.92%.These factors influenced the degree of hydrolysis in the order enzyme substrate concentration ratio（E/S）＞hydrolysis temperature＞hydrolysis time＞pH value.

whey protein；enzyme；degree of hydrolysis

呂志平（1976—），女（漢），工程碩士，研究方向：食品加工工藝。

2011-03-17