野生黑木耳N56菌株的篩選及生長特性研究

呂玉珍，韋林洪

（揚州環(huán)境資源職業(yè)技術(shù)學院，江蘇 揚州 225127）

野生黑木耳N56菌株的篩選及生長特性研究

呂玉珍，韋林洪

（揚州環(huán)境資源職業(yè)技術(shù)學院，江蘇 揚州 225127）

從黑龍江東部山區(qū)的柞櫟木上分離純化采集到61株黑木耳野生菌株，按照常規(guī)育種程序，對這些菌株的性狀進行研究比較，結(jié)果表明：N56號菌株的纖維素酶活力為4633 U/g，生物學效率為93.7，產(chǎn)量為（42±5）g/袋,菌絲生長速率為5.4 mm/d,其各方面性狀皆優(yōu)于對照菌株（當?shù)仄毡橥茝V使用的）黑微29,可作為產(chǎn)業(yè)化開發(fā)的母種進行推廣。

黑木耳；菌株；對照菌株；篩選

木耳營養(yǎng)豐富，含蛋白質(zhì)、脂肪、鈣、碳水化合物、磷、鐵、胡蘿卜素、維生素，此外含有大量纖維、鉀、鎂和鈉等。美國科學家發(fā)現(xiàn)黑木耳能減低血液凝塊、肝和冠狀動脈硬化，并且能明顯地防止血栓的形成。保持黑木耳穩(wěn)產(chǎn)、維持產(chǎn)品質(zhì)量的首位關(guān)鍵因素是生產(chǎn)菌株的真確性，不同菌株的生物學效率相差很大，產(chǎn)品的形態(tài)特征甚至口感不盡相同。大量菌株的品種退化、老化和不利變異，造成栽培特性和產(chǎn)量的不確定性[1]，一些退化的菌株嚴重損害了生產(chǎn)者的利益，獲得一株優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的新菌株勢在必行。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養(yǎng)基

1.1.1.1 母種培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖（PDA）和綜合馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（CPDA），參照文獻[2]配制。

1.1.1.2 原種和栽培培養(yǎng)基（w/w）

闊葉樹木屑78%，麥麩20%，蔗糖1%，石膏1%，含水量（58±2）%。菌袋尺寸17 cm×33 cm，每袋裝干料350 g左右。

1.1.2 菌株

供試菌株系從黑龍江省東部山區(qū)呼瑪、伊春、東寧、勃利、柴河、尚志、雞東等32個地點的柞櫟木上野生黑木耳或耳木上分離，純化后保存在鋸木屑中，共61株菌株；對照菌株黑微29（當?shù)貢充N的主要栽培菌種）。

1.2 方法

1.2.1 菌種分離方法

將自野外收集到的標本,核對原始序號,標本表面用0.1%升汞消毒,無菌水清洗3次～5次,按無菌操作程序進行組織分離。為便于純化接種在直徑Ф90 mmPDA培養(yǎng)皿上，純化后移入試管，同時接入盛有木屑的試管內(nèi)，作為備份[3]。

1.2.2 選育程序

選育工作按常規(guī)育種程序進行，即從收集到的野生菌種資源開始，經(jīng)組織分離、菌種培養(yǎng)、生理性能測定、初篩、復篩、區(qū)別性鑒別等，綜合評價確定入選菌株。

1.2.2.1 初篩[4]

將分離到的61株野生黑木耳菌種和對照菌株黑微29分別接種在PDA培養(yǎng)皿上，28℃，一起培養(yǎng)，隔日觀察生長情況。同時分2批進行拮抗試驗。

將保留下來的18株菌株作為原種進行擴大培養(yǎng)。同時配制栽培培基質(zhì)，嚴格控制含水量和pH，使用15 mm×28 mm耐126℃高溫符合GB 9687-1988《食品包裝用聚乙烯成型衛(wèi)生標準》[4]規(guī)定的聚丙烯塑料袋分裝，高壓滅菌（126 ℃，1.5 h～2 h），冷卻，次日接種，每個菌株接種10袋，重復3次。接種后按常規(guī)管理，定時觀察、記錄菌絲萌發(fā)、蔓延、原基形成、出耳及環(huán)境溫度、濕度狀況；計算供試菌株的鮮重g/袋、干重g/袋和生物學效率。

1.2.2.2 復篩

將初篩中入選的6株菌株進行活化和擴大培養(yǎng)，制成原種，按初篩的方法進行復篩。每組接種30袋，重復3次，在同一條件下栽培，同時做生化測定以確定N56號菌株的真確性。

1.2.2.3 栽培試驗

配制袋栽基質(zhì),袋栽的基質(zhì)為闊葉樹雜木鋸屑。其中鋸屑占78%、糠麩20%、石膏1%和石灰1%，基質(zhì)含水量60%。菌袋尺寸為17 cm×33 cm，每個菌株接種30袋，樣本數(shù)量≥30，符合統(tǒng)計學的大樣本要求，重復3次。接種后按常規(guī)管理，定時觀察和記錄。產(chǎn)品性狀、質(zhì)量按NY/T749-2003《綠色食品食用菌》[5]進行評價。

1.2.3 培養(yǎng)特征觀察

菌絲形態(tài)觀察系將斜面供試菌種中注入適量無菌水，刮下菌苔并搖勻，吸收0.1 mL菌液于裝有PDA培養(yǎng)基的Φ90 cm培養(yǎng)皿上涂布均勻，置于24℃～25℃恒溫箱中，隔日觀察并測量菌絲蔓延速度，記錄生長情況。用Champ Gel全自動凝膠圖像處理系統(tǒng)樣本并計算出菌絲密度[1]。

1.2.4 生長特性研究

將N56號菌株和黑微29黑微29分別接種在PDA培養(yǎng)基和栽培培養(yǎng)基上,作3次重復。設置10個培養(yǎng)溫度（6、10、14、18、22、26、30、34、38、40 ℃），6個初始pH（pH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0），比較菌絲生長速率。

1.2.5 拮抗實驗

將測定菌接種于PDA液體培養(yǎng)基中，28℃、200r/min振蕩培養(yǎng)3 d～5 d。菌懸液離心（12000r/min），取上清，4℃保存?zhèn)溆茫铆傊瑪U散法[6]，拮抗反應的形態(tài)特征隆起型、溝型、隔離型按GB/T12728《食用菌術(shù)語》[7]規(guī)定的定義判定。

1.2.6 纖維素酶活力測定

對培養(yǎng)袋定期取樣，每次取樣樣本重量相同，均為20.0 g，加40 mL生理鹽水，迅速封口，在（40±1）℃水浴中提取酶液，過濾，吸取酶液3 mL，用3，5－二硝基水楊法[8]測定菌絲生長階段和出茹階段的纖維素酶活力。

1.2.7 多糖的測定

從栽培場地中取代表性的子實體,去雜后精確稱取4.00 g，加少量熱水浸泡2 h。反復用濾紙吸干多余水分，加50 mL蒸餾水，進行高壓浸提（0.1 MPa，121 ℃）30 min。濾過取清液，用Seveg法去雜質(zhì)，5倍冰凍乙醇沉淀多糖。用蒽酮比色法在550 nm波長下測定OD值由標準曲線查算還原糖含量[9]。

2 結(jié)果和分析

2.1 菌株篩選

2.1.1 初篩

將61株菌株在PDA斜面試管和PDA培養(yǎng)皿上的生長情況于對照菌株黑微29號的生長情況進行比較，結(jié)果有35株菌株比對照菌株的生長速度慢，菌絲不夠濃密，長勢不健壯而被淘汰。拮抗試驗的目的是檢查各野生菌株上否是獨立的菌株，結(jié)果有8株菌株因無拮抗現(xiàn)象發(fā)生而被淘汰。對入選的18個初篩菌株的生長情況和培養(yǎng)特征進行觀察比較，結(jié)果見表1。

從表1可以看出，各菌株在菌落形態(tài)或菌絲蔓延速度上的特征均不相同。將各菌株的各項指標與對照菌株進行比較,得出的結(jié)果是N4、N7、N11、N18、N38、N56等6 株菌株為比較理想的菌株。

2.1.2 復篩

為了比較初篩菌株的培養(yǎng)特征、纖維素酶活力和栽培試驗對6個初篩菌株進行了復篩，結(jié)果如下。

2.1.2.1 纖維素酶活力的測定結(jié)果注:T為用面積生長指數(shù),指在確定的時段內(nèi),菌絲在平板上擴展的程度及其與參試菌株的比值;ΔS為菌株生長到12 d和14 d菌落面積之差;t為生長指數(shù),即ΔS/ΔS表示相鄰時段凈生長面積與參試菌株的比值。菌絲密度類型的定義方法是求出全部參加觀察的菌絲密度，求出其平均值和標準差Sd。凡菌絲密度≥Sd＋平均值者定為“密”＜Sd＋平均值者定為“稀”，介于二者間定為“中等”。

表1 菌落的形態(tài)特征Table1 The shape characteristics of the fungus community

復篩篩選出的6株菌株的纖維素酶活力，見表2。

表2 6株菌株的纖維素酶活力值Table2 The cellulase activity of 6 strains

由表2證實,菌株的纖維素酶的活力與產(chǎn)量呈正相關(guān)。其中N56號菌株纖維素酶活力居參試菌株之首。

2.1.2.2 產(chǎn)量和生物學效率

6株菌株的產(chǎn)量和生物學效率見表3。

表3 6株菌株的產(chǎn)量和生物學效率Table3 The output and bio-efficiency of 6 strains

生物學效率表達菌種對培養(yǎng)基質(zhì)轉(zhuǎn)化利用能力。復篩試驗再次證明，N56號菌株產(chǎn)量（42.2 g/袋）處于首位，生物學效率達到93.7%，遠遠高于市場上普遍使用的黑微29號菌株的產(chǎn)量。

2.1.2.3 多糖含量

將由6株菌和對照菌株栽培的樣品經(jīng)Seveg法除掉雜質(zhì)，乙醇沉淀后用蒽酮比色法測定多糖含量[8]，結(jié)果如表4。

表4 7株菌株和對照菌株的多糖含量Table4 The polysaccharides content of 7 strains and the control

由表4可以得出，供試野生黑木耳菌株擔子果中多糖的平均含量是1659.2 mg/100 g，高于與對照菌株擔子菌中中多糖含量（1543.4mg/100 g）。

2.2 N56號菌株的生長特性[10]

2.2.1 形態(tài)特征

采用平板觀察法。平皿上的菌落生長12 d后，菌絲呈放射狀延伸，菌絲密度較大，白色無色素，各平行培養(yǎng)的N56號菌株表現(xiàn)均相同。黑微29號稍有色素，較密，邊緣菌絲放射狀延伸。N56號與黑微29菌株的菌落形狀如圖1所示。

2.2.2 生長速度

2種菌株在PDA培養(yǎng)皿上菌落擴展速度如表5所示。

圖1 N56號與黑微29菌株的菌落形態(tài)Fig.1 The fungus community shape of number N56and Heiwei 29 strain

表5 N56與黑微29號菌株的菌落擴展速度Table5 The fungus community extending speed of N56and Heiwei 29 strain mm/d

由表5可以得出，N56號菌株在PDA培養(yǎng)皿上菌落擴展速度與黑微29號菌株相比，初期菌落擴展速度較慢，說明生長較慢，14 d后，在PDA培養(yǎng)皿上菌落擴展速度迅速加快，達到5.4 mm/d，說明生長急速加速，超過了對照株（5.0 mm/d）在PDA培養(yǎng)皿上菌落擴展速度。

2.2.3 pH與N56號菌株菌絲生長

pH對N56號菌株菌絲生長的影響，見圖2。

圖2 pH對N56號菌株菌絲生長的影響Fig.2 The effect of pH on N56hypha growth speed

圖2直觀地說明，N56號菌株菌絲在pH高于4.0時方能萌發(fā)，隨著pH的升高，菌絲生長加速。在pH＝6.0時，菌絲生長速度最快，超過這一pH，菌絲生長速度大為減緩。由此可知，pH6.0～7.0利于菌絲生長，N56號黑木耳菌絲的適宜PH值為6.0左右。

2.2.4 溫度與N56號菌株菌絲生長

溫度對N56號菌株菌絲生長的影響，見圖3。

圖3 溫度與N56號菌株菌絲生長關(guān)系Fig.3 The relation between temperature and N56hypha growth speed

由圖3可知：N56號菌株菌絲在溫度高于7℃時方能萌發(fā)，隨著溫度的升高，菌絲生長加速。在25℃～26℃時，菌絲生長最快，超過這一溫度，菌絲生長大為減緩。故N56號黑木耳菌絲的適宜生長溫度為25℃。

3 結(jié)論

在黑龍江東部山區(qū)采集分離到的61株野生黑木耳菌種按常規(guī)的育種程序，篩選出一株高產(chǎn)菌株，編號為N56號。該菌株的纖維素酶活力為4633 U/g，生物學效率93.7，產(chǎn)量（42±5）g/袋，菌絲生長速度5.4 mm/d，遠遠高于對照株黑微29號。N56號菌株適宜生長條件為溫度25℃、pH6.0。

[1]韓增化，張介馳，張丕奇，等.黑木耳原種胞外酶活性的研究[J].生物技術(shù)，2009，19(5)：14-15

[2]梁恒宇，馬鶯拙，程建軍，等.自然發(fā)酵黃豆醬中嗜鹽乳酸菌的分離、鑒定與篩選[J].中國釀造，2006，161(8)：24-27

[3]鄭稚鷹，潘學仁.食用菌栽培學[M].哈爾濱：黑龍江科學技術(shù)出版社，1995：129-265

[4]中華人民共和國衛(wèi)生部.GB 9687-1988食品包裝用聚乙烯成型衛(wèi)生標準[S].北京：中國標準出版社，1989

[5]中華人民共和國農(nóng)業(yè)部.NY/T749-2003綠色食品 食用菌[S].北京：中國標準出版社，2004：3

[6]Holt JG,Krieg NR,Sneath pH,et al.Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology[M].Int J syst Evil Microbiol，2007：2259-2261

[7]中華人民共和國衛(wèi)生部.GB/T12728-2006食用菌術(shù)語 [S].北京：中國標準出版社，2006：12

[8]張金霞，謝寶貴.食用菌菌種生產(chǎn)與管理手冊[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2006：18-76

[9]李守勉，李明，田景花，等.8個杏鮑茹菌株胞外酶活性及蛋白質(zhì)含量的研究比較[J].食用菌學報，2007，29(6)：11-12

[10]李鳳梅，王曉，張雙靈，等.自然發(fā)酵酸菜汁中乳酸菌分離鑒定[J].中國釀造，2008，128(5)：33-35

Screening of Auricularia Auricular Strains with High Production and the Research of its Growth Characteristics

Lü Yu-zhen，WEI Lin-hong
（Yangzhou Vocational College of Environment and Resource，Yangzhou，225127，Jiangsu，China）

In this study，61 wild Auricularia auricula strains，isolated from quercus oka wood in east mountain area of Heilongjiang province，were sampled.Through conventional breeding procedure，the characteristics of these strains were made further comparison.Results showed that the cellulase activity，bio－efficiency，output and hypha growth speed of number N56strain were 4633 U/g，93.7，（42 ±5）g/bag，5.4 mm/d，respectively.It was also to say that all aspects of this stain were better than the controlled strain Heiwei 29（widely used in local area）.In conclusion，number N56strain could spread as stock strain in industrial production.

Auricularia auricular；strain；controlled strain；screening

呂玉珍（1969—），女（漢），副教授，本科，研究方向：食品科學。

2011-03-02