條斑紫菜活性肽的制備及其功能性質(zhì)研究

姚興存，李靜，舒留泉

（淮海工學(xué)院江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 連云港 222005）

條斑紫菜活性肽的制備及其功能性質(zhì)研究

姚興存，李靜，舒留泉

（淮海工學(xué)院江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 連云港 222005）

采用木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶水解紫菜蛋白制備活性肽，以水解度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，優(yōu)化酶水解條件；研究條斑紫菜活性肽的溶解性、乳化性與乳化穩(wěn)定性、起泡性與泡沫穩(wěn)定性等功能性質(zhì)。結(jié)果表明，3種酶解物都具有良好的溶解性且在等電點(diǎn)附近不沉淀，乳化性及其穩(wěn)定性不如紫菜蛋白且隨著pH升高而增強(qiáng)，酸性條件下起泡性較好，胰蛋白酶解物起泡性最強(qiáng)。

條斑紫菜；活性肽；水解條件；功能性質(zhì)

條斑紫菜（Porphyra yezoensis）是長(zhǎng)江以北江蘇沿海人工養(yǎng)殖的大型食用海藻。紫菜的主要成分有約50%的碳水化合物和30%的粗蛋白[1]，此外還含有豐富的維生素、礦物質(zhì)及生物活性物質(zhì)等。國(guó)內(nèi)紫菜的主要利用途徑是作為干品直接食用，精深加工產(chǎn)品幾乎是空白。利用當(dāng)?shù)厥a(chǎn)的條斑紫菜，提取其中蛋白質(zhì)，選取作用環(huán)境分別為酸性的胃蛋白酶、中性的木瓜蛋白酶、堿性的胰蛋白酶作為水解酶，將紫菜蛋白水解為生物活性肽，確定蛋白酶的最佳作用條件，研究紫菜活性肽的功能性質(zhì)，以進(jìn)一步開(kāi)發(fā)紫菜保健食品，提高紫菜的利用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

條斑紫菜為2010年3月連云港西墅物產(chǎn)有限公司生產(chǎn)的紫菜餅干品，凱氏定氮法[2]測(cè)定其蛋白質(zhì)含量為33%。實(shí)驗(yàn)室中將紫菜50℃烘干至恒重，粉碎機(jī)粉碎，100目過(guò)篩后超臨界CO2流體萃取脫除脂肪，儲(chǔ)于廣口瓶中干燥保存。

木瓜蛋白酶(酶活力為3×104U/g)、胰蛋白酶（酶活力為2.5×105U/g）、胃蛋白酶（酶活力為3×105U/g）購(gòu)于上海生工有限公司；十二烷基磺酸鈉（SDS）等化學(xué)試劑皆為國(guó)產(chǎn)分析純；玉米胚芽油購(gòu)于連云港大潤(rùn)發(fā)超市。

1.2 主要儀器

T6新世紀(jì)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；Duo Flow層析系統(tǒng)：美國(guó)Bio-Rad公司；Primo R多用途臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：美國(guó)熱電公司；Pro250精密勻漿器，美國(guó)Pro Scientific公司；PHS-3C精密pH計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；FW-100高速萬(wàn)能粉碎機(jī)：天津市泰斯特儀器有限公司；KS-300超聲波粉碎機(jī)：寧波科生儀器廠；RE-501旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：南京金正科教儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 紫菜蛋白活性肽的制備

精確稱(chēng)取一定量紫菜干粉，加100 mL水混合均勻，超聲輔助提取15 min，4000 r/min離心10 min，取上清液定容到100 mL。將3份提取液分別調(diào)節(jié)pH至7.0、8.0、2.0，分別加入木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶等3種蛋白酶，充分均勻后按各自的最佳水解條件分別進(jìn)行酶解，每間隔20 min振蕩1次，酶解結(jié)束后，100℃滅酶10 min，自然冷卻后8000 r/min離心15 min，上清液即為紫菜蛋白酶解液（活性肽），冷藏備用。

1.3.2 蛋白質(zhì)水解度的測(cè)定

式中：DH為蛋白質(zhì)水解度，%；N1為水解液中總氨基態(tài)氮含量，（g/mL）；N2為樣品的總氮含量，（g/mL）。

水解液中總氨基態(tài)氮含量根據(jù)中性甲醛電位滴定法測(cè)定[2]，樣品總氮含量按凱氏定氮法測(cè)定[2]。

1.3.3 溶解性測(cè)定

測(cè)定方法依照參考文獻(xiàn)[3]。將酶解液濃縮4倍，取20 mL樣液，用HCl或NaOH溶液分別調(diào)pH 2.0、4.0、6.0、8.0、10.0，各取10 mL進(jìn)行凱氏定氮[2]。另10 mL分別加入等體積的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%三氯乙酸（TCA），混勻后放置30 min，5000 r/min離心15 min，取上清液進(jìn)行凱氏定氮[2]，測(cè)可溶性氮含量，則樣品液三氯乙酸氮溶解指數(shù)（TCA-NSI）為：

1.3.4 乳化性和乳化穩(wěn)定性的測(cè)定

乳化性和乳化穩(wěn)定性的測(cè)定為濁度法[4]。取3種酶解液和未酶解樣品液各21 mL，加入9 mL玉米油混合均勻，分別調(diào)pH至2.0、4.0、6.0、8.0、10.0，取3 mL室溫下14000 r/min均質(zhì)1 min，分別在靜置0 min和30 min后從容器底部取0.03 mL乳狀液放入比色皿中，用3 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%SDS溶液稀釋?zhuān)?00 nm處測(cè)吸光度，以SDS溶液空白調(diào)零。以靜置0 min后測(cè)出的OD值表示其乳化性，0 min和30 min后OD值的差值表示其相對(duì)乳化穩(wěn)定性。乳化性（EAI）和乳化穩(wěn)定性（ESI）分別按下式計(jì)算：

式中：C為樣品濃度，（g/mL）；L為比色杯光徑，cm；A0為初始乳化液的吸光度；A30為30 min后的吸光度；Φ為乳化液中油相的比例；N為稀釋倍數(shù)；t為2次測(cè)定乳化性的時(shí)間間隔（這里t=30）。

1.3.5 起泡性和泡沫穩(wěn)定性的測(cè)定

測(cè)定方法依照參考文獻(xiàn)[5]。將酶解液濃縮10倍，取20 mL樣液，分別調(diào)pH2.0、4.0、6.0、8.0、10.0，取6 mL用高速勻漿器10000 r/min攪打1 min，立即倒入量筒并記錄泡沫體積，靜置30 min后，再記錄其泡沫體積。起泡性（FC）和泡沫穩(wěn)定性（FS）分別按下式計(jì)算：

式中：V0為攪打前的液體體積，mL；V1為攪打停止時(shí)的泡沫體積，mL；V2為攪打停止30 min后的泡沫體積，mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶的水解條件研究

蛋白酶水解時(shí)受到溫度、水解時(shí)間、酶用量和酸堿度的影響最大。為此，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)采用了L9（34）的正交試驗(yàn)，研究因素間的交互作用。木瓜蛋白酶水解試驗(yàn)的因素和水平如表1，表2為其正交試驗(yàn)結(jié)果與極差分析。

表 1 木瓜蛋白酶水解正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of papayin hydrolysis

表 2 木瓜蛋白酶水解正交試驗(yàn)結(jié)果與極差分析Table 2 Result and range analysis of the orthogonal test of papayin hydrolysis

由極差分析比較可以看出，因素對(duì)木瓜蛋白酶水解紫菜蛋白影響的主次順序是ACDB，即溫度對(duì)紫菜蛋白的水解度影響最大，其次是酶用量、酶解時(shí)間和pH。由此，確定水解各因素的最優(yōu)水平組合為A2B2C2D3，即最佳水解條件為：水解溫度55℃，pH7.0，酶用量1%，水解時(shí)間為5 h。

在此條件下，進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得紫菜蛋白的水解度平均值為13.85%，說(shuō)明最佳工藝條件下具有最大水解度。

同樣方法，正交試驗(yàn)研究胃蛋白酶、胰蛋白酶的最佳水解條件，可以得到類(lèi)似的結(jié)果，將3種酶水解紫菜蛋白優(yōu)化后的水解條件列于表3。

表 3 3種酶的適宜水解條件Table 3 The optimum hydrolyzing conditions of three kinds of enzymes

2.2 溶解性

不同pH條件下酶解液和未水解液的三氯乙酸氮溶解指數(shù)（TCA－NSI）見(jiàn)圖1。

由圖1可以看出，未酶解蛋白及酶解液在pH4～6時(shí)（等電點(diǎn)附近）溶解性皆較低；與未酶解蛋白相比，蛋白酶解液的溶解性顯著增大，這主要由于酶水解使得蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)破壞，肽鏈長(zhǎng)度變小，更小的分子和新暴露的離子化氨基與羧基提高了水解產(chǎn)物的親水性，從而增加了其溶解性。TCA-NSI指數(shù)也是蛋白質(zhì)水解程度的重要指標(biāo)。

2.3 乳化性和乳化穩(wěn)定性

3種酶解液的乳化性測(cè)定結(jié)果如圖2所示，未進(jìn)行酶水解的紫菜蛋白液的乳化性見(jiàn)圖3，酶解液和未水解液的乳化穩(wěn)定性見(jiàn)圖4。

由圖2和圖3可以看出，在研究的pH范圍內(nèi)，未水解紫菜蛋白乳化性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于蛋白酶解物；隨著pH的升高，乳化性呈現(xiàn)明顯的上升趨勢(shì)，酸性環(huán)境中的乳化能力要弱于堿性環(huán)境；3種酶解液中，胰蛋白酶酶解液的乳化性最大，胃蛋白酶次之，木瓜蛋白酶最小。蛋白質(zhì)與肽的乳化性與分子表面的親水、疏水基團(tuán)及分子大小有關(guān)，酶法水解時(shí)，蛋白質(zhì)被降解成短肽鏈，使大量的疏水性基團(tuán)暴露并幾乎完全親水，則其乳化能力降低。另外，對(duì)于同一種蛋白酶解物，在不同pH下的乳化性有一定差別，隨著pH升高，其所帶負(fù)電荷增多，乳化性則有一定程度的增強(qiáng)。

從圖4乳化穩(wěn)定性的變化來(lái)看，在考查的pH范圍內(nèi)，3種酶水解液和未水解液的乳化穩(wěn)定性均較小，在pH6時(shí)穩(wěn)定性最差。究其原因，一是由于紫菜蛋白的水解，酶解液中多為相對(duì)分子質(zhì)量較小的肽，其乳化穩(wěn)定性降低；二是無(wú)論是原始蛋白質(zhì)溶液還是酶解液的濃度均較低，即使能夠形成一定的乳化狀態(tài)也不會(huì)維持太長(zhǎng)時(shí)間。

2.4 起泡性和泡沫穩(wěn)定性

3種酶解液和未水解液的起泡性見(jiàn)圖5，泡沫穩(wěn)定性見(jiàn)圖6。

根據(jù)圖5和圖6，蛋白酶解液和未酶解液在酸性條件下起泡性皆較好，但未發(fā)現(xiàn)兩者之間的明顯差異；蛋白質(zhì)起泡性與分子表面基團(tuán)的極性有關(guān)，隨著pH降低，極性基團(tuán)增多，提高了表面疏水性，起泡性增強(qiáng)。在泡沫穩(wěn)定性方面，胃蛋白酶和胰蛋白酶酶解液的泡沫穩(wěn)定性較好，木瓜蛋白酶酶解液的泡沫穩(wěn)定性較差；泡沫穩(wěn)定性在pH3～6的酸性環(huán)境下較差，隨著pH的升高，泡沫穩(wěn)定性增加，由于決定泡沫穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素在于液膜的強(qiáng)度，而液膜強(qiáng)度主要取決于表面吸附膜的堅(jiān)固性，當(dāng)pH>6時(shí)表面活性較高，故泡沫穩(wěn)定性也高。

3 結(jié)論

通過(guò)實(shí)驗(yàn)，確定了3種蛋白酶制備紫菜活性肽的適宜水解條件和制備工藝流程。

功能性研究結(jié)果表明，采用不同蛋白酶水解紫菜中的蛋白質(zhì)，由于酶水解后，蛋白質(zhì)被水解為短肽鏈，提高了紫菜蛋白的溶解性且在等電點(diǎn)附近不易沉淀，擴(kuò)大了紫菜蛋白在食品工業(yè)中的應(yīng)用范圍；紫菜蛋白質(zhì)酶解物乳化活性隨著pH的升高而增強(qiáng)，但遠(yuǎn)不及原始蛋白質(zhì)；酶解物在酸性條件下起泡性較好，其中胰蛋白酶解物起泡性最強(qiáng)。

[1]姚興存，邱春江，穆春林.條斑紫菜營(yíng)養(yǎng)成分與季節(jié)變化的研究[J].水產(chǎn)養(yǎng)殖，2002(5)：34-35

[2]張水華.食品分析實(shí)驗(yàn)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2006：45-49

[3]陳升軍，熊華，李庭，等.米渣蛋白酶解及酶解物功能性質(zhì)研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2008，34(5):114-118

[4]汪芳安，王慧溪，李永麗，等.米渣肽理化性質(zhì)的研究[J].食品工業(yè)科技，2009，30(10):127-130

[5]郭興鳳，馬維琦，張娟娟.酶法提取米渣中的蛋白質(zhì)的功能性研究[J].河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2009，30(10):4-8

Study on Preparation and Properties of Bioactive Oligopeptide from Porphyra yezoensis Proteins

YAO Xing-cun，LI Jing，SHU Liu-quan
（Jiangsu Key Laboratory of Marine Biotechnology，Huaihai Institute of Technology，Lianyungang 222005，Jiangsu，China）

In the research，Porphyra yezoensis proteins were hydrolyzed by papayin，trypsin and pepsin to prepare active peptides.The degree of hydrolysis was used as an index to optimize hydrolyzing conditions.Such properties as solubility，emulsibility，emulsion stability，foaming ability and foam stability of the peptides were also studied.The results showed that all of the three hydrolysates had good solubility and did not precipitate in the isoelectric point.The emulsibility and emulsion stability were not as good as Porphyra yezoensis proteins，and increased as pH rose.The foaming ability was good under the acidic condition，with trypsin hydrolysates the strongest.

Porphyra yezoensis；bioactive oligopeptide；hydrolyzing conditions；function properties

江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題（2008HS015）

姚興存（1963—），男（漢），副教授，本科，研究方向：海洋貝藻類(lèi)精深加工與利用。

2011-03-13