薄層色譜法測定蜂蜜中高果糖淀粉糖漿

張穎璐，劉明剛，李琳

（天津市質量監督檢驗站第六十九站，天津 301609）

如今蜂蜜市場中出現了許多摻假現象，這些人利用高果糖淀粉糖漿具有顏色和味道與蜂蜜極為相似，但價值比蜂蜜便宜很多的特點，向蜂蜜中摻入高果糖淀粉糖漿，為此，鑒別真假蜂蜜的技術也應運而生，主要有同位素質譜法、薄層色譜法等，由于同位素質譜法所采用的儀器設備較為昂貴，所以薄層色譜法被廣泛使用[1]。

1 材料與方法

1.1 試劑和材料

無水乙醇（分析純）；正丁醇（分析純）；冰乙酸（分析純）；丙酮（分析純）；磷酸（優級純）；85%磷酸；活性炭：DarcoG-60或相當者，100目；硅藻土：Celite545助濾劑或相當者；二苯胺鹽酸鹽（C.A.S.：537－67－7）；苯胺:重蒸餾。

乙醇溶液（7＋93）：移取35 mL無水乙醇至500 mL試劑瓶中，加人465 mL水混勻。

乙醇溶液（1＋3）：移取125 mL無水乙醇至500 mL試劑瓶中，加人375 mL水混勻。

乙醇溶液（1＋1）：移取250 mL無水乙醇至500 mL試劑瓶中，加人250 mL水混勻。

薄層展開劑：正丁醇＋冰乙酸＋水（2＋1＋1）。

顯色劑：稱取1.0 g二苯胺鹽酸鹽（3.9）至盛有50.0 mL丙酮（4.4）的燒杯中，再加入1 mL苯胺（3.10），混合攪拌，同時加人5 mL 85%的磷酸（3.6），此時會有白色絮狀出現，完全溶解后可使用。此顯色劑要臨用時現配，各種試劑要按以上順序添加。

薄層層析板:硅膠G板200 mm×200 mm或100 mm×200 mm（根據實際做樣品數選擇合適規格的硅膠G板），膜厚0.25 mm，使用前應畫板，畫板方法為下端留2 cm，左邊和右邊各留2 cm，從下端2 cm處向上量3.5 cm位置畫線，此線為Rf值，從下端2cm處向上量10cm位置畫線，此線為爬板終點線，爬過此線視為爬板結束，畫好板后要在110℃恒溫干燥箱中活化1 h后，置于干燥器中放冷至室溫，備用。

水：本實驗中所用水均為經濾膜抽濾過的蒸餾水。

1.2 儀器和設備

HW.B-2恒溫干燥箱：天津東方實驗廠；RE-52AA旋轉蒸發器：上海亞榮生化儀器廠；玻璃噴霧器:薄層色譜用；SHZ－D（Ⅲ）真空抽氣泵（可調真空度0～100 kPa）：北京萊伯泰科儀器有限公司；薄層色譜展開槽；微量注射器（10 μL）；AEG220G分析天平（感量:0.0001 g）：日本島津公司；電吹風機；層析柱：帶旋塞的玻璃管，內徑20 mm～22 mm，長300 mm～400mm。

1.3 方法

試樣中的高分子糖，經活性炭—硅藻土柱的富集、濃縮，再用薄層色譜法分離、檢測，經與摻有一定含量的高果糖淀粉糖漿的純蜂蜜比較，來判定蜂蜜中高果糖淀粉糖漿的存在。

1.3.1 活性炭柱-硅藻土柱的裝填與保存

用玻璃棉將脫脂棉包成小包塞在柱子底部，關掉活栓后加水到玻璃管的中部，放水除去玻璃棉中的氣泡至水量約10 mL時關掉活栓。在小燒杯中稱取2.0 g的硅藻土（1.1.8），加入少量的水攪拌注入管中，自然沉降后在玻璃棉的上方堆積成約1 cm厚的硅藻土層。稱取活性炭（1.1.7）和硅藻土混合物（1＋1）12 g，加入50 mL的水攪拌均勻注人管中（由于硅藻土和活性炭比重不同，必須攪拌均勻后方可注入管中，否則會影響柱效）。打開活栓，在真空抽氣泵的吸引下使混合物沉降堆積，用水將粘在管壁的混合物沖洗干凈，整個過程需要用150 mL水來過柱，水面到達柱面1 cm時關掉活栓。再次注入用水混合后的2.0 g硅藻土，讓其自然沉降后，在真空抽氣泵吸引下，用500 mL水預洗活性炭柱，通過調節真空抽氣泵的真空度控制流速在8.5 mL/min左右。液面到達柱上1 cm時關掉活栓，備用。注意：以上操作過程中均不能將柱子抽干。

應在使用前填裝，如暫時不用，可用乙醇溶液（1＋1）150 mL浸泡，用保鮮膜和生料帶封口，此法可保存3個月，用前再用500 mL水預洗。若用水封，則可保存1個月。

1.3.2 試樣制備與保存

對無結晶的實驗室樣品，將其攪拌均勻。對有結晶的樣品，在密閉情況下，置于不超過60℃的水浴中溫熱，振蕩，待樣品全部融化后攪勻，迅速冷卻至室溫。分出0.5 kg作為試樣。制備好的試樣置于樣品瓶中，密封，并標明標記。將試樣于常溫下保存。

1.3.3 分析步驟

1.3.3.1 樣品前處理

1）過柱

在50 mL燒杯中稱取1 g（精確到1 mg，且小數點后第4位應小于5）試樣。溶于10 mL水后，緩慢加到活性炭－硅藻土柱上，打開活栓，在真空抽氣泵吸引下，使試料溶液通過柱子。分2次各用5mL水沖洗燒杯后，沖洗液也加人柱中，液面下降到柱面上端時應關閉活栓，停止吸引，不要抽干液體。量取乙醇溶液（7＋93）300 mL（每次100 mL，分3次）加到活性炭柱中，真空抽吸控制流速在8 mL/min左右，棄掉流出液。然后再加人乙醇溶液（1+3）100 mL，在同樣條件下洗脫，洗脫液全部棄掉，并將液體抽干，觀察活栓下不再有液體滴下，視為已抽干。然后將接收瓶換成在干燥器中干燥過的具塞錐形瓶，再加入乙醇溶液（1+1）100 mL，在同樣條件下洗脫，將洗脫液全部收集，并要收集完全，觀察不再有液體滴入錐形瓶為止。

2）旋轉蒸發

用旋轉蒸發器在80℃水浴中蒸干，開始溫度不要過高，設置在65℃左右為佳，溫度慢慢升高，這個過程要注意不要使錐形瓶中的液體沸騰而丟失，否則會造成樣品丟失。將錐形瓶中的液體蒸干后，向瓶中加入1 mL水，用玻璃棒把粘在瓶底及瓶身的混合物洗下來，然后過水系濾頭，轉移至2 mL小管中，作為薄層層析用點樣液。

1.3.3.2 對照樣品的制備與保存

分別稱取1 g蜂蜜，1 g蜂蜜并加入0.0650 g糖漿、1 g蜂蜜并加入0.1300 g糖漿（注：1 g蜂蜜精確到1 mg，且小數點后第4位應小于5）。后按1.3.3.1操作，制備對照樣品純蜂蜜，含有5%、10%糖漿蜂蜜。標準液可以一次制備冷凍保存，長期使用。

1.3.3.3 薄層層析

1）點板

用10 μL微量注射器在距離薄層板下端2 cm的位置，點上6.0 μL的樣液，同時水平間隔2 cm，點上同樣量經過同樣處理的純蜂蜜和含有5%、10%糖漿的蜂蜜的標準液作為對照。點樣時點越小，越集中爬板效果就越好，點一下就要迅速用吹風機吹干。

2）爬板

點樣結束后把薄層板放入展開槽中（薄層展開前，展開槽用展開劑蒸氣預飽和過夜，用一張濾紙將展開槽四壁圍好，并將展開槽密封），按傾斜上行法展開，為加快爬板速度可將展開槽放在溫度較高的室內，以加快分子反應速度。當展開劑前沿爬過薄層板終點線時即可。

3）顯色

從展開槽中取出薄層板，用吹風機把展開劑完全吹散后，把顯色劑（1.1.15）均勻噴霧在薄層板上，等顯色劑完全蒸發后，放入110℃的恒溫干燥箱中烘7 min～10 min使之顯色。

1.3.3.4 結果判定

從恒溫干燥箱中取出薄層板，觀察顯色情況，純蜂蜜只在Rf值0.35以上的區域有2個～3個藍色中帶灰色或咖啡色的斑點，相比較糖漿或混有糖漿的蜂蜜卻是從原點開始呈現藍色帶狀樣的斑點群。混有糖漿5%的蜂蜜，如果點樣6 μL，可出現混有糖漿蜂蜜一樣的特點。因此，假如從原點開始到Rf值0.35附近有藍色帶狀斑點群出現，應考慮混有由淀粉轉化來的高果糖淀粉糖漿，此時判定陽性。檢出限為5%。

2 結果與討論

2.1 結果表述

用陰性和陽性表示。

出現斑點群位置在Rf值0.35以下，斑點顏色和含有5%糖漿相比較要深一些的判定為陽性（+），表示摻有高果糖淀粉糖漿。

出現斑點群位置在Rf值0.35以上或出現斑點群位置在Rf值0.35以下但斑點顏色和含有5%糖漿相比較要淺一些的判定結果為陰性（-），表示沒有高果糖淀粉糖漿。

2.2 方法的適用性

為了驗證該方法的適用性，選擇了油菜、洋槐、紫云英、荊條、棗花、椴樹、葵花、蕎麥等8種蜂蜜樣品，這些樣品來源可靠，并已經碳同位素法確認是純正蜂蜜，對這些樣品進行了空白及添加5%、10%高果糖淀粉糖漿的實驗，薄層色譜圖見圖1[2-7]，結果如表1。

表1 8種蜂蜜添加5%、10%高果糖淀粉糖漿檢驗結果Table 1 The test results of 8 kinds of honey and added 5%，10%high fouctose stearch sgrup

從圖1、表1可以看出，本法適用于上述8種蜂蜜的鑒別，因此可選擇來源可靠，并已經碳同位素法確認的純正蜂蜜作為標準純蜂蜜，同時在純蜂蜜中分別添加5%和10%高果糖淀粉糖漿作為實驗對照。

圖2是11個批次蜂蜜，用薄層色譜法測定高果糖淀粉糖漿的譜圖。

由圖2可以看出，出現斑點群位置在Rf值0.35以下，斑點顏色和含有5%糖漿相比較要深一些的樣品判定為陽性（+），表示摻有高果糖淀粉糖漿。其他情況均判定為陰性（-）。由此可以判定，9#、10#、11#、12#、13#、28#、26#為陽性，含有高果糖淀粉糖漿。

3 結論

根據大量的實驗和比較，使用薄層色譜法可以有效地檢測出蜂蜜中高果糖淀粉糖漿的含量，從而鑒定蜂蜜的真偽，有效保護消費者的利益。

[1]龐國芳，范春林，曹彥忠，等.蜂蜜中高果糖淀粉糖漿薄層色譜鑒別技術的研究[J].中國養蜂，2003，54：16-19

[2]中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局.GB/T 18932.2-2002蜂蜜中高果糖淀粉糖漿的測定方法薄層色譜法[S].北京：中國標準出版社，2002

[3]中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局.GB/T 18932.1-2002,蜂蜜中碳-4植物糖含量測定方法穩定碳同位素比率法[S].北京：中國標準出版社，2002

[4]龐國芳，范春林，曹彥忠，等.穩定碳同位素技術測定蜂蜜中碳-4植物糖的方法研究[J].中國養蜂，2003，54：5-9

[5]中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局.GB/T6379-1996測定方法的精密度通過實驗室間實驗確定標準方法的重復性和再現性[S].北京：中國標準出版社，1996

[6]中華人民共和國衛生部藥典委員會.中華人民共和國衛生部藥典[M].1985版，二部.化學工業出版社.廣東科技出版社，1995

[7]Kushnir,I J Assoc.Official methods of analysis of AoAc international 17th Edition[J].off Anal Chem，1979，62(4)：917