金針菇子實體多糖的抗氧化活性的研究

傅明輝，洪梅達(dá)

（廣東工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程系，廣東 廣州 510006）

食用菌多糖具有免疫調(diào)節(jié)，抗腫瘤作用，調(diào)節(jié)血糖、降血脂作用，抗氧化，抗衰老作用以及抗輻射和抗突變作用，廣泛應(yīng)用于臨床治療以及保健功能上。如香菇多糖具有廣譜的抗病毒、抗腫瘤及刺激巨噬細(xì)胞活性和對膽固醇的溶解作用，并能作為調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)的T細(xì)胞促進(jìn)劑，通過刺激抗體的產(chǎn)生提高機(jī)體的免疫功能[1-5]；靈芝子實體多糖能增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬活力，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，改善造血功能，增強(qiáng)機(jī)體的防御功能[5-6]，同時具有降血糖、降血脂的作用[7-8]。茶樹菇子實體多糖具有抗氧化的活性[9]。

金針菇（Flammulina velutipes）又名樸菇、冬菇，是一種常見食用菌，具有豐富的營養(yǎng)價值。據(jù)分析，金針菇（干制品）含有豐富的蛋白質(zhì)（31.2%）、碳水化合物（60.2%）和粗脂肪（5.8%），還含有VB1、VB2、VC等多種維生素，其含量豐富的精氨酸和賴氨酸對促進(jìn)少年兒童智力發(fā)育具有良好作用，日本人把它譽(yù)為“增智菇”[10]。金針菇不但食用價值高，還具有一定的藥用價值。據(jù)報道，其子實體提取物具有保肝及抗腫瘤作用[11-12]，其多糖是一個以葡聚糖為主、由數(shù)個多糖組分構(gòu)成的混合多糖[13]，能夠增強(qiáng)機(jī)體免疫力[14]，具有抗凝血[15]等生理功能，但有關(guān)金針菇多糖的抗氧化作用的研究還鮮有報道。本文對金針菇多糖進(jìn)行分離、純化并對其抗氧化活性進(jìn)行研究，研究結(jié)果為金針菇多糖的進(jìn)一步開發(fā)和利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金針菇：購自廣州長湴市場。昆明種小白鼠：購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心。DEAE52、Sephadex S-200：Sigma公司；其余化學(xué)試劑均為國產(chǎn)。

1.2 儀器與設(shè)備

高速組織搗碎機(jī)（DS-1型）：上海標(biāo)本模型廠制造；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（RE-52A型）：上海亞榮生化儀器廠；低速離心機(jī)（KDC-40型）：大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司；可見分光光度計（1201型）：北京瑞利分析儀器公司；自動部分收集器（BSZ-100）：上海滬西分析儀器廠有限公司。

1.3 方法

1.3.1 提取

稱取100 g新鮮金針菇子實體，加適量蒸餾水，勻漿。保持料液比為1∶40（g∶mL），在100 ℃水浴中加熱攪拌3 h，過濾，如此反復(fù)3次，合并收集濾液，離心30 min（4000 r/min），取上清液濃縮至小體積。加入3倍體積的無水乙醇沉淀，離心，收集沉淀。將沉淀溶解于水中，在透析袋中，對自來水透析24 h，再對蒸餾水透析48 h。Sevage法脫蛋白，重復(fù)脫蛋白5次。加入3倍體積無水乙醇沉淀，在4℃冰箱中靜置過夜。離心，收集沉淀，以無水乙醇洗滌。離心15 min（4000 r/min），除去乙醇，干燥，得粗多糖。樣品中蛋白質(zhì)含量的測定采用考馬斯亮藍(lán)法。

1.3.2 多糖的DEAE離子交換柱層析

DEAE52-纖維素離子交換柱層析（10 mm×200 mm），用0.05mol/L NaCl溶液洗脫，流速0.75mL/min，收集4 mL/管，苯酚-硫酸顯色法測定多糖含量。65℃～70℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)樣液，濃縮至1 mL后，真空干燥獲得純多糖A1和A2。

1.3.3 多糖的凝膠柱層析

取經(jīng)DEAE柱純化得到的多糖A2樣品，用少量0.05 mol/L NaCl溶液溶解，65℃～70℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至1 mL～2 mL。樣品加入Sephadex S-200凝膠柱中（16 mm×500 mm），用濃度為0.05 mol/L NaCl溶液洗脫，流速0.2 mL/min，收集2 mL/管，苯酚-硫酸顯色法測定多糖。

1.3.4 多糖抗氧化活性的檢測[16]

選取體重20 g左右的健康小鼠，脫頸椎處死，取肝臟以0.9%生理鹽水研磨成2%的勻漿液。取1.5 mL勻漿液，加入0.5 mL純化后的A2組分（或生理鹽水作對照），混勻，靜置10min，然后放入37℃恒溫箱中振蕩1.5h，取出加入1.5 mL 20%三氯乙酸，混勻以終止氧化反應(yīng)，10 min后1000 r/min離心10 min。取上清液1.5 mL加入0.5 mL 0.67%硫代巴比妥酸，沸水浴10 min，冷卻后用分光光度計測光密度（波長=540 nm）。另取1.5 mL勻漿液，加入1.5 mL 20%三氯乙酸先終止反應(yīng)，然后再加入0.5 mL純化后的A2組分（或生理鹽水），余下步驟同上，用作空白調(diào)零，取3個不同濃度的樣品，每個濃度分別取3支平行管，記錄結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖的分離與純化

100g新鮮金針菇經(jīng)熱水浸提后制備粗多糖1.092g，提取率1.092%。

粗多糖經(jīng)DEAE52-離子交換柱后的結(jié)果見圖1，圖中可見2個明顯的峰，說明粗多糖中包含2種組分A1和A2（A1和A2不一定是純品）。多糖A2再經(jīng)過SephadexS-200凝膠柱層析后，結(jié)果見圖2，得到一個基本對稱單峰，說明A2組分是純的多糖。

圖1 DEAE52柱層析洗脫圖譜Fig.1 The elution curve of DEAE52 column chromatography

2.2 多糖抗氧化活性的測定

金針菇多糖樣品抗氧化活性檢測數(shù)據(jù)如表1所示。

圖2 Sephadex S-200柱層析洗脫曲線Fig.2 The elution curve of Sephadex S-200 column chromatography

表1 金針菇多糖的抗氧化作用Table 1 The anti-oxidant activity of polysaccharide from Flammulina velutipes

本實驗的結(jié)果顯示，生理鹽水為對照，金針菇多糖的3個濃度均有抗氧化作用。在樣品濃度較低，為0.007 mg/mL時，OD值下降了36.5%，隨著樣品濃度升高到0.014 mg/mL和0.028 mg/mL時，OD值下降百分率分別達(dá)到40.0%及48.5%，其光密度降低都具有比較明顯的差異，量效關(guān)系顯著，即隨著濃度的升高，抗氧化作用明顯上升。

3 結(jié)論

我國是食用菌生產(chǎn)大國，食用菌的開發(fā)和利用具有重要的意義。食用菌多糖是食用菌中一種重要的活性物質(zhì)，具有抗腫瘤、抗病毒及提高機(jī)體免疫功能等生物學(xué)活性，這在香菇、靈芝、蟲草、姬松茸等常見食用菌中以得到證實[1-9，17-19]，金針菇多糖也具有抗腫瘤、提高機(jī)體免疫的活性，但有關(guān)金針菇多糖的抗氧化研究鮮有報道。本研究采用熱水浸提的方法分離金針菇多糖，結(jié)合DEAE52-纖維素離子交換柱層析和Sephadex S-200凝膠柱層析純化多糖，得到單一多糖組分A2，并對其抗氧化活性進(jìn)行了研究，研究結(jié)果表明金針菇具有明顯的抗氧化活性，且抗氧化活性呈現(xiàn)劑量效應(yīng)，隨濃度升高而升高，該研究結(jié)果為金針菇的進(jìn)一步開發(fā)和利用提供一定的參考。

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