2-甲氧基雌二醇對CEM細胞增殖的影響及其機制研究

張學亞，潘敬新，郭熙哲，戰 榕

2-甲氧基雌二醇(2-methoxyestradiol，2-ME2)是17β-雌二醇在體內的生理代謝產物，由雌二醇2位碳原子先羥基化再甲基化而來，化學名為17β-2-甲氧基雌-1，3，5(10)-三烯-3，17-二醇［1］。具有選擇性殺傷腫瘤細胞［2］，而對正常細胞毒性小［3］以及對雌激素受體α和β無依賴性［4］等特點，受到人們的廣泛關注。有研究表明［2］2-ME2在體外能夠抑制多種不同組織來源的腫瘤細胞增殖，體內動物模型試驗亦表明2-ME2具有明顯的抑制腫瘤增殖及減少腫瘤負荷的作用。但其確切作用機制尚不明確。本文選擇人急性T淋巴細胞白血病細胞株CEM作為2-ME2體外研究模型，探討其對CEM細胞的抗腫瘤作用及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料 主要試劑:人急性T淋巴細胞白血病細胞株CEM細胞(福建省血液病研究所細胞庫);2-ME2購自Sigma公司，用二甲基亞砜(DMSO，Sigma公司)溶解配成2 mmol·L-1原液，4℃保存備用，實驗前用細胞培養液稀釋，DMSO終濃度＜0.1%。標準胎牛血清為杭州四季青公司產品，RPMI 1640為Gibco公司產品，Akt、p-Akt(ser473)兔多抗購自Cell Signaling Technology公司，β-actin鼠單抗為武漢博士德公司產品，蛋白酶抑制劑為上海康成生物工程有限公司產品，化學發光底物試劑和辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗鼠、羊抗兔抗體均購自Pierce公司。

1.2 方法

1.2.1 人急性淋巴細胞白血病CEM細胞株的培養常規復蘇人急性淋巴細胞白血病CEM細胞，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養液，于37℃、5%CO2飽和濕度條件下進行培養，2～3 d換液傳代1次。所有實驗均采用對數生長期細胞。

1.2.2 MTT法檢測2-ME2對CEM細胞增殖活性的影響 將CEM細胞(1×108·L-1)接種于96孔培養板中，經不同濃度的2-ME2作用48 h，實驗結束前4 h加入MTT(Amresco公司)，繼續培養4 h，加入二甲基亞砜，振蕩10 min充分溶解結晶，置酶標儀(美國Stat公司，Fax-2100型)上用492 nm和630 nm雙波長測吸光度值(A值)。細胞增殖抑制率/%=(1-用藥組平均A值/對照組平均A值)×100%［6］。

1.2.3 RT-PCR法檢測2-ME2對CEM細胞VEGF和hTERT mRNA表達的影響 收集2 μmol·L-12-ME2作用不同時間后的待測細胞，1/15 mmol·L-1PBS洗滌后，用TRIzol試劑(Invitrogen公司產品)提取各組細胞總RNA，操作按產品說明書進行。紫外分光光度計分析及瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的含量、純度及完整性。cDNA第1鏈的合成按反轉錄試劑盒(Promega公司產品)說明書進行。以βactin為內參照，經凝膠圖像分析儀(Gel Doc 1000型，美國Bio-Rad公司產品)對PCR結果進行半定量分析。所用引物序列應用oligo軟件自行設計，由上海英駿生物技術有限公司合成。引物序列如下:VEGF:上游引物序列，5′-GAAGTGGTGAAGTTCATGGATGTC-3′;下游引物序列，5′-CGATCGTTCTGTATCGTCTTTCC-3′，產物長度為 541 bp，退火溫度，64℃;hTERT:上游引物序列，5′-CGGAAGAGTGTCTGGAGCAA-3′，下游引物序列，5′-GGATGAAGCGGAGTCTGGA-3′，產物長度為 145 bp，退火溫度，60℃;β-actin:上游引物序列，5′-ATCTGGCACCACACCTTCTACAATGAGCTGCG-3′，下游引物序列，5′-CGTCATACTCCTGCTTGCTGATCCACATCTGC-3′，產物長度為887 bp，退火溫度，56℃。PCR擴增的有關參數如下:94℃變性5 min后進入下列循環:94℃變性30 s，最佳退火溫度40 s，72℃延伸共32個循環后，72℃延伸7 min。制備含核酸燃料的1.5%瓊脂糖凝膠，取5 μl反應產物加適量溴酚藍點樣電泳10 min，經凝膠圖像分析儀(Gel Doc 1000型，Bio-Rad)拍照并進行半定量分析，以目的基因電泳條帶的熒光強度值與β-actin電泳條帶熒光強度值的比值表示相對表達水平［6］。

1.2.4 Western blot法檢測2-ME2對CEM細胞Akt和p-Akt蛋白表達的影響 收集2 μmol·L-12-ME2作用不同時間后的待測細胞，預冷的PBS洗滌兩遍后，加入 M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent(Pierce公司)細胞裂解液提取細胞總蛋白，充分裂解后，低溫離心機12 000 r·min-1離心10 min，BCA 法(Pierce公司)定量蛋白濃度，取20 μg蛋白，加入上樣緩沖液，99℃變性5 min，10% ～15%的SDS-PAGE凝膠電泳分離后，電轉移至硝酸纖維素膜(GE公司)上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，一抗4℃孵育過夜后加相應二抗室溫孵育2 h，TBST緩沖液洗滌3次，每次10 min，用化學發光底物試劑(Pierce公司)檢測分析［6］。

1.3 統計學分析 采用統計軟件SPSS 13.0對實驗數據進行單因素方差分析。組間分析采用t檢驗。

2 結果

2.1 2-ME2對CEM細胞增殖的影響 不同濃度2-ME2明顯抑制CEM細胞的增殖，隨著作用濃度增加，細胞增殖的抑制率逐漸增高，抑制率50%時濃度為 2 μmol·L-1(Fig 1)。

2.2 2-ME2對 CEM 細胞 VEGF和 hTERT mRNA表達的影響 RT-PCR結果可見，2 μmol·L-1作用CEM細胞24 h后，hTERT mRNA表達水平即有減弱，并隨作用時間延長趨勢越明顯，同時，VEGF mRNA表達水平隨作用時間延長而逐漸減弱，作用72 h，已幾乎檢測不到VEGF mRNA的表達。實驗組與對照組相比差異均具有統計學意義(P＜0.05，Fig 2)。

Fig 1 Effect of 2-ME2 on CEM cell proliferation at different concentrations at 48 h

Fig 2 Variation of hTERT，VEGF gene mRNA in CEM cells after treatment with 2 μmol·L －12-ME2*P＜0.05 vs control

2.3 2-ME2對CEM細胞 Akt、p-Akt蛋白表達的影響 2-ME2處理CEM細胞24 h后，p-Akt蛋白表達水平急劇下降，作用48 h后達到最低。而總Akt蛋白表達水平則無變化。實驗組與對照組相比，差異均具有統計學意義(P＜0.05，Fig 3)。

3 討論

白血病是一組異質性的造血系統惡性腫瘤，造血干/祖細胞在分化過程的不同階段發生惡性增殖是其重要致癌機制之一。其中端粒酶活性增強及異常活躍的腫瘤血管新生可導致白血病細胞增殖失控，進而誘發白血病發生。因此，抑制白血病細胞端粒酶活性和血管新生已成為造血系統惡性腫瘤治療的新策略［7-8］。其中，hTERT是維持端粒酶活性最重要的成分，hTERT與端粒酶活性呈平行相關，hTERT活性表達被認為是端粒酶激活的限速步驟［9-10］。章堯等［11］研究報道三氧化二砷體外能夠有效抑制HL-60增殖，這與下調hTERT mRNA表達相關。我們的研究發現不同濃度2-ME2能夠抑制白血病細胞株CEM的增殖，呈現劑量依賴關系，其半數抑制濃度(IC50)為2 μmol·L-1。RT-PCR 實驗研究結果顯示，2-ME2抑制CEM細胞增殖的過程中，hTERT mRNA表達水平隨著細胞增殖抑制程度的升高而逐漸下降。提示下調hTERT mRNA表達參與了2-ME2抑制CEM細胞增殖的過程。

Fig 3 Variation of Akt，p-Akt in CEM cells after treatment with 2 μmol·L －12-ME2*P＜0.05 vs control

血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是目前活性最強的血管生長因子，VEGF不僅對實體瘤的發生發展產生明顯影響，而且在多數造血系統惡性腫瘤中也起重要作用［12］，VEGF在白血病發生中的作用還不夠明確，很可能VEGF通過結合其相應的受體，進一步使Akt磷酸化促進PI3K/Akt信號通路的轉導，進而促進癌細胞的生存與增殖［11］。Akt是一種絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶，Akt信號通路是細胞內重要信號轉導通路之一，它與人類多種腫瘤的發生發展關系密切，有資料顯示［13-14］在很多腫瘤的發生發展過程中Akt活性增高，是抗腫瘤藥物治療的有效作用靶點。因此，通過抑制VEGF的表達而干擾PI3K/Akt信號通路的轉導，成為一種新的藥物抗腫瘤機制。我們的結果顯示2-ME2作用CEM細胞24 h后，VEGF mRNA表達即有明顯降低，并呈現時間依賴性，同時，p-Akt的表達24 h呈現急劇下降趨勢，48 h達到最高抑制效應，而總Akt蛋白表達水平則無變化。這表明2-ME2可以通過抑制VEGF表達而阻斷Akt信號通路轉導從而達到抑制CEM細胞增殖的作用。由于Akt信號通路網絡錯綜復雜，2-ME2干擾該通路轉導是否還存在其他因素，還有待于進一步研究。

總之，我們研究發現2-ME2體外能夠有效抑制CEM細胞增殖，降低hTERT mRNA表達和部分通過降低VEGF mRNA表達而阻斷PI3K/Akt信號通路可能是其作用機制。

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