青蒿琥酯抗大鼠免疫性肝纖維化的作用及機制研究

來麗娜，楊柳絮，郭春花，張曉一，王黎敏，范毅敏

肝纖維化是多種慢性肝病向肝硬化發展的必經階段。現普遍認為肝纖維化屬可逆性病變，但目前仍沒有療效確切且不良反應少的抗肝纖維化藥物。我國中藥資源豐富，從天然藥物中發掘抗肝纖維化的藥物具有廣闊的前景。

青蒿素是從黃花蒿中提取的一種含內過氧化基團的倍半萜內酯化合物。青蒿素及其衍生物具有抗瘧、免疫抑制、抗病毒及抗腫瘤等多方面藥理作用，且不良反應較少［1］。青蒿琥酯(artesunate，Art)為青蒿素水溶性的衍生物。我們前期研究發現［2］，青蒿琥酯對CCl4混合因素所致的大鼠肝纖維化有防治作用，本實驗制備免疫性大鼠肝纖維化模型，進一步探討青蒿琥酯的抗肝纖維化作用及其可能機制，為其開發成抗肝纖維化藥物提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物與HSC-T6細胞株 Wistar大鼠，♀♂各半，清潔級，體質量175 ～200 g，購自山西醫科大學實驗動物中心。HSC-T6細胞株由長治醫學院肝病研究所趙中夫教授惠贈。

1.1.2 實驗藥品和試劑 青蒿琥酯，廣西桂林制藥二廠;秋水仙堿(colchicine，Col)，昆明股份制藥有限公司，批號070509;不完全弗氏佐劑，Sigma公司產品;牛血清白蛋白(Albumin Bovine，BSA)，Amresco公司產品分裝;羥脯氨酸(hydroxyproline，Hyp)，上海潤成生物科技有限公司，分析純，批號20090322。TGF-β1(Sigma公司)，RNAiso Plus抽提試劑(TaKa-Ra公司)，DL2000 DNA Marker(TaKaRa公司)，RNA PCR Kit(AMV)Ver3.0(TaKaRa公司)，Western細胞裂解液(碧云天生物技術研究所)，HRP標記的anti-Mouse IgG(Promega公司)，小鼠來源GAPDH一抗(碧云天生物技術研究所)，小鼠來源collagenⅠ一抗(Abcam公司)，PCR引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2 方法

1.2.1 動物模型制備及分組 將弗氏不完全佐劑與同體積的18 g·L-1BSA生理鹽水溶液混合并順時針研磨制成9 g·L-1BSA弗氏不完全佐劑乳劑。除正常組外。每只大鼠每次0.5 ml足墊注射，共5次。第1、2次間隔2周，其余間隔1周。末次致敏注射后1周，球后靜脈叢采血測抗BSA抗體。取抗體陽性者尾靜脈攻擊注射5 g·L-1BSA生理鹽水溶液(0.1 ml·kg-1)，每周2次，共10次。大鼠隨機分為正常對照組、模型組、大、中、小劑量 Art組(5、15、45 mg·kg-1)、Col組(0.1 mg·kg-1)。治療組自尾靜脈攻擊注射BSA生理鹽水開始灌胃給藥，模型組和正常對照組灌胃同劑量蒸餾水，每日1次，直至實驗結束。實驗結束后，股動脈放血制備血清，-20℃冰箱保存。同時留取肝臟組織用于各項檢測。

1.2.2 肝組織病理學觀察 取肝左葉相同部位，10%甲醛溶液固定，石蠟切片，Masson染色，光鏡下觀察膠原纖維增生情況。

1.2.3 肝組織Hyp的測定 肝組織脫脂，研磨烘干，衡重后取組織粉末40 mg裝入定做的安瓿中，加入6 mol·L-1HCl 6 ml乙醇噴燈封口，105℃烤24 h，冷卻后敲開安瓿，取50 μl放入試管中烘干待測，參照 Jamall的方法［3］。

1.2.4 RT-PCR 檢測肝組織 α-SMA、TGF-β1mRNA的表達 RNAiso Plus提取肝組織總RNA，定量。以總RNA 1 μg為模板，用oligo(dT)作為引物。TGF-β1(547 bp)［4］:上游 5′-GCG GTG CTC GCT TTG T-3′，下游 5′-GGA AGG GTC GGT TCA T-3′;α-SMA(542 bp):上游 5′-CTG TCC CTC TAT GCC TGT GG-3′，下游 5′-AGG GCT GTG ATC TCC TTC TG-3′;βactin(300 bp):上游 5′-AGC TGA GAG GGA AAT CGT GCG-3′;下游 5′-GTG CCA CCA GAC AGC ACT GTG-3′。PCR產物進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析系統測定條帶的灰度值，以目的條帶與β-actin條帶灰度值之比作為半定量標準。

1.2.5 HSC-T6細胞的培養和分組 采用含10%胎牛血清的DMEM培養基，常規培養于37℃、5%CO2培養箱中。實驗分為對照組，TGF-β1刺激組(5 μg·L-1)，聯合處理組(Art終濃度［5］6.25、25、50 mg·L-1+5 μg·L-1TGF-β1)。細胞生長至 80%以上融合度時，全部換含無血清的DMEM培養液同步化處理12 h后吸棄培養液。TGF-β1組換含5 μg·L-1TGF-β1的培養液，聯合處理組用 5 μg·L-1TGF-β1預處理 30 min 后［6］再加入不同濃度的 Art作用24 h。

1.2.6 RT-PCR檢測HSC-T6細胞 ProcollagenⅠmRNA 的表達 ProcollagenⅠ(698bp)［7］:上游 5′-CCT GGC AAG AAC GGA GAT GAT-3′;下游 5′-ACC GAC AGC ACC ATC GTT ACC-3′。

1.2.7 Western blot檢測HSC-T6細胞collagenⅠ蛋白的表達 裂解液裂解細胞，蛋白定量。取總蛋白50 μg，經10%聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉移到硝酸纖維素膜上，封閉后分別加入一抗，4℃過夜，洗膜后再與辣根過氧化物酶偶聯的二抗雜交，加入ECL發光液。X線底片曝光。以目的條帶與內參照GAPDH條帶灰度值的比值代表蛋白的表達量。

1.3 統計學分析 采用SPSS 11.5軟件分析，實驗數據以±s表示，均數間比較采用單因素方差分析，多組間比較用SNK法。

2 結果

2.1 Art對大鼠肝組織病理變化的影響 正常組大鼠肝小葉結構完整清晰，肝細胞呈索狀分布，板間有不規則肝竇，匯管區無擴大。模型組正常小葉結構被破壞，肝細胞索排列紊亂，膠原纖維構成的纖維間隔破壞界板，分割包繞肝小葉，有半數以上有假小葉形成。Art組大部分肝小葉結構接近正常，僅匯管區有少量纖維增生，肝索排列趨于整齊，少許尚留有較細的纖維條索但無小葉包繞。Col組肝細胞索排列紊亂，膠原纖維增生程度較模型組輕，有纖維條索分割包繞小葉，但未見明顯的假小葉的形成，見Fig 1。

Fig 1 Effect of Art on the histological morphology of immunological hepatic fibrosis rat liver by Masson staining(×75)A:Normol group;B:Model group;C:Art treated group(5 mg·kg-1);D:Art treated group(15 mg·kg-1);E:Art treated group(45 mg·kg-1);F:Col treated group(0.1 mg·kg-1).

2.2 Art對大鼠肝組織Hyp的影響 與正常組比較，模型組大鼠肝臟Hyp含量明顯升高(P＜0.01)。與模型組比較，Art各劑量組大鼠肝組織中Hyp的含量明顯降低(P＜0.01)，與Col組比較差異無顯著性，見Tab 1。

Tab 1 Effect of Art on content of hyproxyproline in immunological hepatic fibrosis rat liver( ± s，n=10)

Tab 1 Effect of Art on content of hyproxyproline in immunological hepatic fibrosis rat liver( ± s，n=10)

△P＜0.05，△△P ＜0.01 vs normal group;＊＊P ＜0.01 vs model group

Group Dose/mg·kg-1 Hyp/mg·g-1liver Normol 0.511±0.184 Model 2.556±0.588△△Art 5 0.946±0.257＊＊15 0.725±0.297＊＊45 0.816±0.282＊＊Col 0.1 1.229±0.306△＊＊

2.3 Art對大鼠肝組織 α-SMA、TGF-β1mRNA 表達的影響 RT-PCR結果顯示，模型組α-SMA and TGF-β1mRNA表達明顯高于正常組(P＜0.01);Art 15、45 mg·kg-1治療組 α-SMA mRNA表達明顯低于模型組(P＜0.01)，Art 5 mg·kg-1組和Col組與模型組比較，α-SMA mRNA表達也降低(P＜0.05)，Art 15、45 mg·kg-1治療組和 Col組 TGF-β1mRNA表達明顯低于模型組(P＜0.01)，Art 5 mg·kg-1組與模型組比較，TGF-β1mRNA表達也降低(P＜0.05)，見 Fig 2。

Fig 2 Effect of Art on expression of α-SMA and TGF-β1 mRNA in immunological hepatic fibrosis rat liverˉ±s，n=6)A:Expression of α-SMA mRNA was detected by RT-PCR;B:Expression of TGF-β1mRNA was detected by RT-PCR;C:The densitometric analysis for relative changes in the indicated groups.M:DNA marker;1:normol group;2:Model group;3:Art treated group(5 mg·kg-1);4:Art treated group(15 mg·kg-1);5:Art treated group(45 mg·kg-1);6:Col treated group(0.1 mg·kg-1).△P ＜0.05，△△P ＜0.01 vs normal group;*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs model group

2.4 Art對 HSC-T6ProcollagenⅠmRNA 和 collagenⅠ蛋白表達的影響 從Fig 3中可以看到，TGF-β1組ProcollagenⅠmRNA和collagenⅠ蛋白表達明顯高于對照組(P＜0.01)，與 Art共培養后，Art 6.25、25、50 mg·L-1ProcollagenⅠmRNA 和 collagenⅠ蛋白的表達明顯降低(P＜0.01)，Art 50 mg·L-1尤為明顯。

Fig 3 Effect of Art on expression of procollagenⅠmRNA and collagenⅠproteins in HSC-T6 cells(±s，n=6)A:Expression of procollagenⅠmRNA was detected by RT-PCR assay;B:Expression of collagenⅠprotein was detected by Western blot assay;C:The densitometric analysis for relative changes in the indicated groups.M:DNA marker;1:Control group;2:TGF-β1group;△P ＜0.05，△△P ＜0.01 vs control group;*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs TGF-β1group.

3 討論

有報道青蒿素類化合物能治療結締組織增生性疾病，對CCl4引起的小鼠肝損傷有保護作用，以青蒿鱉甲湯為主方配合辨證用藥，能明顯降低乙型肝炎患者血清透明質酸、Ⅲ型前膠原、層粘蛋白、Ⅳ型膠原。前期動物實驗表明Art對CCl4混合因素造成的大鼠肝纖維化有防治作用。肝纖維化的發生原因有許多，任何致病因子造成的肝臟損害和炎癥，均可引起纖維組織增生及沉積而形成肝纖維化。大鼠免疫性肝纖維化模型更接近人類肝纖維化的病理機制［8］。實驗中觀察到大鼠在造膜結束后肝組織Masson膠原染色可見由膠原纖維構成的纖維間隔自匯管區向肝小葉內延伸，交織成網狀。經Art預防治療后，大鼠膠原纖維增生程度明顯減輕，甚至無膠原纖維增生或僅在匯管區和中央靜脈有少量纖維組織增生，其纖維化程度明顯低于模型組。模型組肝組織Hyp含量明顯升高，而Art組明顯下降，這與肝組織形態學觀察反映出的各組肝纖維化程度相一致。

HSC的活化和增殖在肝纖維化的發生、發展過程中起關鍵作用。表達α-SMA是HSC活化的標志。實驗中觀察到正常大鼠肝臟幾乎無 α-SMA mRNA的表達，肝纖維化大鼠肝組織α-SMA mRNA表達增高，而Art組可以抑制α-SMA mRNA表達，從而推斷Art抑制肝纖維化與抑制HSC活化有關。

肝細胞、Kupffer細胞、肝竇內皮細胞等受損后釋放的TGF-β1是啟動鄰近靜息態HSCs激活和轉化的初始信號之一。而后由HSC通過自分泌方式使 TGF-β1持續增高，TGF-β1反饋作用于 HSCs，并不斷刺激自身的增殖并合成Ⅰ型膠原等各種細胞外基質在肝內異常沉積，最終導致肝纖維化［9］。有研究證實［10］，細胞因子中只有 TGF-β1能刺激 HSC 合成膠原纖維，而其他細胞因子則只刺激 HSC增殖。實驗當中正常大鼠肝組織幾乎未見TGF-β1表達，模型組高表達，提示TGF-β1的表達與纖維化的形成與發展是密切相關的。Art可以抑制肝組織TGF-β1mRNA的表達。

體外以 HSC-T6 為對象，用 5 μg·L-1TGF-β1刺激HSC-T6，結果所示活化后的HSC-T6對TGF-β1刺激信號仍是敏感的，經過TGF-β1刺激，Ⅰ型前膠原mRNA表達增高，Ⅰ型膠原蛋白分泌增多，與Art共培養后發現Ⅰ型膠原的量比單獨使用TGF-β1刺激時明顯減少。表明Art對HSC有直接抑制作用。其機制可能在于影響TGF-β1細胞內信號轉導，從而下調細胞內Ⅰ型前膠原的基因轉錄，進而抑制Ⅰ型膠原的產生，起到抑制肝纖維化的作用。Art對TGF-β1受體后信號通路的影響有待于進一步的研究。

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