七氟醚和異氟醚對不同濃度羅庫溴銨抑制乙酰膽堿受體內向電流的影響

劉 力，閔 蘇，魏 珂

羅庫溴銨(rocuronium，Roc)是臨床上常用的非去極化肌松劑，能與乙酰膽堿(acetylcholine)競爭性結合神經肌接頭突觸后膜成人型乙酰膽堿受體(εnAChR)，阻斷神經沖動傳導，發揮肌松作用。麻醉誘導時采用預注小劑量肌松劑來提高肌松起效時間，但不能增強肌松程度。揮發性吸入麻醉藥能夠明顯增強非去極化肌松劑的肌松作用，兩種藥物復合用于麻醉誘導能夠加快起效時間并提高肌松效果。本實驗通過脂質體轉染建立表達大鼠ε-nAChR的HEK293細胞模型［1］，比較兩種常用的揮發性吸入麻醉藥七氟醚(sevoflurane，Sev)和異氟醚(isoflurane，Iso)對不同濃度羅庫溴銨與ε-nAChR結合后內向電流的影響，以闡明揮發性吸入麻醉藥復合不同劑量非去極化肌松劑的濃度效應關系。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑 羅庫溴銨標準品，批號:X1-081201，由仙琚公司 (中國)提供。七氟醚、異氟醚購自美國雅培公司。細胞培養和轉染相關試劑分別購于美國Sigma公司和Invitrogen公司。

1.2 載體質粒的構建 從成年大鼠骨骼肌勻漿中提取 ε-nAChR 亞基 α、β、δ、ε 基因，分別插入原核細胞表達質粒后通過測序鑒定，再亞克隆到真核細胞表達質粒pcDNA3.1。基因測序鑒定pcDNA3.1α、pcDNA3.1β、pcDNA3.1δ、pcDNA3.1ε 4 種載體質粒連接正確(載體質粒由廣州弗爾博生物公司構建)。

1.3 細胞培養 HEK293細胞株(重慶醫科大學分子生物實驗室提供)在37℃、含5%CO2的培養箱中用DMEM培養基(Hyclone公司 含體積分數為10%小牛血清、1 ×105U·L－1青霉素、100 mg·L－1鏈霉素、2 mmol·L－1谷氨酰胺)培養24 h。培養2～3 d和實驗前用0.25%胰酶消化傳代1次(密度為1×105)。

1.4 HEK293細胞脂質體轉染及功能鑒定 將pcDNA3.1α、pcDNA3.1β、pcDNA3.1δ、pcDNA3.1ε以2∶1∶1∶1比例與10 μl Lipofectamine 2000(Invitrogen公司，美國)混合，加Opti-MEM培養基至1 ml，孵育20 min后，加入HEK293培養皿中。培養8 h后更換為DMEM培養基，再培養24 h即行膜片鉗檢測。用空pcDNA3.1質粒轉染HEK293細胞作為陰性對照。不含目的基因質粒轉染的HEK293細胞，ACh(Sigma公司，美國)不能激發電流;而含目的基因的質粒轉染的HEK293細胞，ACh可激發電流。

1.5 揮發性吸入麻醉藥飽和灌流液的制備 50 ml的七氟醚或異氟醚(雅培公司，美國)加入到充滿400 ml灌流液的密封玻璃瓶中，在室溫下平衡24 h以上。通過氣相色譜儀(HP6890)測定濃度。

1.6 電生理記錄 用配置好的細胞外液(NaCl 140 mmol·L－1、KC1 5.4 mmol·L－1、CaCl21.8 mmol·L－1、MgCl 1.0 mmol·L－1、HEPES 10 mmol·L－1、葡萄糖 11.1 mmol·L－1、阿托品 1 μmol·L－1，以NaOH調pH至7.4)替換細胞培養基，以1～2 ml·min－1速度灌注。電極內液成分為CsC1 150 mmol·L－1、HEPES 10 mmol·L－1、EGTA 5 mmol·L－1、Mg-ATP 2 mmol·L－1，以 CsOH 調 pH 至7.3。用 PC-10微電極拉制儀(Narishige公司 日本)拉制微電極。電極電阻為2～5 MΩ。應用全細胞膜片鉗記錄電流。電刺激脈沖的給出及電信號的采集通過digidatal 1200放大器(美國Axon Instruments公司)完成。采樣頻率1 000 Hz，低通Bessel濾波0.5 kHz。封接電阻大于1 GΩ時，吸破細胞膜成全細胞狀態。

1.7 分組和給藥方式 分別用6種不同濃度的羅庫溴銨標準品和七氟醚、異氟醚平衡溶液處理重組HEK293 細胞 30 s，再給予 100 μmol·L－1ACh，記錄峰電流。給肌松藥前后單用ACh激動受體，記錄的電流的平均值作為基礎值。給藥間隔2～3 min，并用細胞外液持續沖洗，以減少細胞脫敏感。擬合羅庫溴銨和七氟醚、異氟醚的量效曲線，得出3種藥物的半數有效抑制濃度(IC50)。實驗根據羅庫溴銨的濃度分為 Roc(IC5)、Roc(0.5 IC50)、Roc(IC50)3大組，每組根據處理不同分為七氟醚組 (Sev組)和異氟醚組(Iso組)。各組用0.5 IC50的吸入麻醉藥水溶液處理重組細胞1 min后，分別用相應濃度的羅庫溴銨處理細胞 30 s，給予 100 μmol·L－1ACh，記錄峰電流。各組以單純使用相應濃度的羅庫溴銨為對照。

1.8 數據分析 采用Clampex和Clamfit軟件進行電流圖形、數據處理。計量資料以±s表示。電流抑制率=1－［(測得峰電流/兩次給ACh后電流平均值)×100%］。量效曲線的擬合用Origin軟件(Microcal Software公司，美國)完成，其中IC50用Hill公式得出。統計分析采用SPSS 18.0軟件的單因素方差分析，組間比較用LSD法。

2 結果

2.1 載體質粒構建鑒定 用ACh對含目的基因質粒轉染的HEK293細胞、不含目的基因質粒轉染的細胞和未轉染的細胞激動受體的膜片鉗功能鑒定(Fig 1)。ACh只能激動含目的基因質粒轉染的HEK293細胞的內向電流，而對空質粒轉染細胞和無轉染細胞無激動作用。

Fig 1 Acetylcholine(100μmol·L－1)induced currents in untransfected cell HEK293 cell transfected by non-target gene plasmid，and HEK293 cell expressing mouse adult-type muscle nicotinic acetylcholine receptors

2.2 羅庫溴銨、七氟醚和異氟醚對ε-nAChR抑制作用的量效關系 羅庫溴銨、七氟醚和異氟醚對重組HEK293細胞上 ε-nAChR的 IC50的值分別為:(150.45±12.5)μmol·L－1(95%置信區間115.70 μmol· L－1～ 185.19 μmol· L－1)。(824.27 ±14.73)μmol·L－1(95% 置信區間 783.36 μmol·L－1～865.17 μmol·L－1);(1031.53 ±62.91)μmol·L－1(95%置信區間 856.85 μmol·L－1～1206.22 μmol·L－1)。3種藥物對 ε-nAChR呈劑量依賴性的阻斷作用。其作用強度為羅庫溴銨＞＞七氟醚＞異氟醚，差異有統計學意義(P＜0.05)。見Fig 2、3。

Fig 2 Concentration-effect curves of rocuronium for inhibition of acetylcholine-induced(100 μmol·L －1)currents in HEK293 cell expressing mouse adult-type muscle nicotinic acetylcholine receptors

Fig 3 Concentration-effect curves of isoflurane and sevoflurane for inhibition of acetylcholine-induced(100 μmol·L －1)currents in HEK293 cell expressing mouse adult-type muscle nicotinic acetylcholine receptors

2.3 濃度為0.5 IC50七氟醚、異氟醚預處理對3種不同濃度的羅庫溴銨抑制ε-nAChR內向電流幅度的影響 用濃度為0.5 IC50的七氟醚、異氟醚溶液處理ε-nAChR后，羅庫溴銨抑制ACh誘發ε-nAChR內向電流的抑制率與對照組比較，差異有統計學意義(P＜0.01)。Sev和Iso各處理組中進行組內比較，ROC1組與ROC2、ROC3組的內向電流抑制率差異均有統計學意義(P＜0.01)。ROC2組與ROC3組比較差異無統計學意義(P＞0.05)。Sev和Iso兩處理組相同濃度水平的羅庫溴銨進行組間比較，ROC1組的內向電流抑制率差異有統計學意義(P＜0.01)。ROC2組和ROC3組的內向電流抑制率差異均無統計學意義(P＞0.05)。見Fig 4。

Fig 4 Compare inhibition rate of inward current of acetylcholine receptors between three different concentration of rocuronium after pretreatment of sevoflurane and isoflurane(±s)＊＊P＜0.01 vs Roc(IC5);△△P＜0.01 vs Roc(0.5 IC50);##P＜0.01 vs Sev+Roc;★★P ＜0.01 vs Iso+Roc

3 討論

揮發性吸入麻醉藥能增強NDMRs的肌松作用，其作用機制可能與揮發性吸入麻醉藥結合nAChR的位點促進NDMRs與受體的結合有關。揮發性吸入麻醉藥與nAChR受體跨膜區中的M2區結合促進NDMRs與nAChR的α-ε與α-δ亞基交界處的受體胞外部結合，增強抑制nAChR通道電流，阻滯通道開放［2］。本研究結果表明異氟醚、七氟醚存在條件下，非去極化肌松劑對結合位點親和力的變化導致離子通道功能改變的效應［3］。臨床上進行麻醉誘導時，常預給小劑量的肌松劑后再給予插管所需劑量的肌松劑。該方法雖能明顯提高肌松劑的起效時間，但不能增強肌松效果，因而導致藥物的浪費。揮發性吸入麻醉藥復合小劑量肌松劑用于麻醉誘導可能充分發揮肌松協同作用達到插管劑量的肌松效果。本研究證明羅庫溴銨在較低的濃度水平時，七氟醚、異氟醚均能發揮明顯的協同作用，異氟醚作用略強于七氟醚。隨著羅庫溴銨劑量的進一步增加，七氟醚、異氟醚的協同能力相似且趨于緩和。該結果提示在麻醉誘導時預給小劑量肌松劑復合一定濃度的揮發性吸入麻醉藥能發揮單次大劑量肌松劑同等的肌松作用。本實驗中為了比較異氟醚和七氟醚對NDMRs增強效應，使用揮發性麻醉藥的等效濃度使其具有相近的nAChR阻滯能力。根據文獻報道吸入麻醉藥等效抑制濃度與MAC換算關系［4］，濃度為 0.5 IC50的異氟醚相當于 1.8MAC;濃度為0.5 IC50的七氟醚相當于1.3 MAC。有臨床研究報道該MAC濃度的異氟醚和地氟醚對維庫溴銨的增強效應相同［5］。這與本研究中異氟醚和七氟醚對高劑量的羅庫溴銨的協同作用結果相似。

本實驗運用分子生物學基因重組和受體克隆技術，構建表達大鼠骨骼肌成人型乙酰膽堿受體的細胞模型。該方法已被國內外廣泛用于研究肌肉和神經型乙酰膽堿受體［6－7］。本實驗中僅涉及異氟醚、七氟醚對羅庫溴銨抑制ε-nAChR峰電流的影響，尚需進一步研究對ε-nAChR通道開放的時效影響。

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