葉酸受體及二氫葉酸還原酶與人乳腺癌細(xì)胞MCF-7/ADR多藥耐藥的關(guān)系

黃 瀚，李 兵，歐陽林旗2，，李佐軍，劉世坤2，

乳腺癌是危害婦女健康的主要惡性腫瘤，復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率高，化療可改善乳腺癌治療效果和提高生存率，但腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的多藥耐藥常使化療效果不佳并最終導(dǎo)致化療失敗。葉酸受體(folate receptor，F(xiàn)OLR)可介導(dǎo)細(xì)胞外葉酸進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，有研究［1］發(fā)現(xiàn)乳腺癌細(xì)胞膜上FOLRα表達(dá)增加，而利用反義寡核苷酸抑制乳腺癌細(xì)胞MDA-MB/435的FOLRα表達(dá)后，該細(xì)胞對阿霉素(adriamycin，ADR)的敏感性增加了5倍［2］;二氫葉酸還原酶(dihydrofolate reductase，DHFR)基因是FOLRα的下游基因，高海德等［3］觀察到雙突變 DHFR基因(酶活性增高)對大劑量氨甲喋呤(methotrexate，MTX)化療小鼠骨髓細(xì)胞具有保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)旨在探討FOLRα及其下游基因DHFR的表達(dá)與乳腺癌細(xì)胞多藥耐藥的關(guān)系，并驗(yàn)證DHFR抑制劑甲氨蝶啶能否逆轉(zhuǎn)耐藥細(xì)胞系MCF-7/ADR的多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)，為臨床乳腺癌化療方案設(shè)計(jì)提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 人乳腺癌阿霉素敏感細(xì)胞系MCF-7和耐藥細(xì)胞系MCF-7/ADR購自北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院;阿霉素(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)，甲氨蝶啶(四川正安醫(yī)藥有限公司);MTT(Sigma公司)，DMSO(Amresco公司)，胎牛血清(杭州四季清生物有限公司)，RPMI 1640培養(yǎng)液(Hyclone公司);RNA提取劑TRIzol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒(Fermentas公司);免疫組化試劑盒及鼠抗人P-gp一抗(福建邁新生物技術(shù)公司)，F(xiàn)OLRα一抗(Santa Cruz Biotechnology);美國 ABI 2720型 PCR儀;德國Eppendorf公司高速低溫離心機(jī);德國Eppendorf生物分光光度儀。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 兩株細(xì)胞均用含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的 RPMI 1640培養(yǎng)液于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。MCF-7/ADR細(xì)胞株培養(yǎng)過程中加入1 μmol·L-1的ADR用以維持其耐藥性。定期在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)與生長狀況。收集細(xì)胞并計(jì)數(shù)，繪制細(xì)胞生長曲線。

1.2.2 MTT法測定ADR的細(xì)胞毒性［4］取對數(shù)生長期細(xì)胞用0.25%胰酶消化調(diào)整MCF-7和MCF-7/ADR 細(xì)胞濃度為1×108·L-1，每孔 100 μl接種于96孔板中，每細(xì)胞株設(shè)10個(gè)濃度梯度，分別為128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25 μmol·L-1，每個(gè)濃度梯度設(shè)4個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)陰性對照組(在含細(xì)胞的培養(yǎng)孔內(nèi)加等量培養(yǎng)液)和調(diào)零組(不接種細(xì)胞，僅加等量培養(yǎng)液)，于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。加入不同濃度ADR，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，每孔加入 5.0 g·L-1的 MTT 溶液 20 μl，培養(yǎng) 4 h，吸除上清液，每孔加入 DMSO 150 μl，振蕩器震蕩10 min，490 nm波長處用酶標(biāo)儀測定每孔吸光度值(OD)，計(jì)算ADR對細(xì)胞的抑制率，并由此計(jì)算IC50及耐藥倍數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。抑制率(IR/%)=［1-(試驗(yàn)組OD值/對照組OD值)］×100%，孫氏法求半數(shù)抑制濃度(IC50)，耐藥倍數(shù)=MCF-7/ADR細(xì)胞IC50/MCF-7細(xì)胞IC50。

Tab 1 Primer sequences and product size in real time PCR

1.2.3 RT-PCR檢測細(xì)胞FOLRα、DHFR mRNA的轉(zhuǎn)錄水平 用TRIzol試劑按照說明書提取細(xì)胞內(nèi)總RNA，1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，紫外分光光度計(jì)檢測RNA的濃度和純度。用RevertAidTMFirst-Strand cDNA合成試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物用Primer3在線設(shè)計(jì)(Tab 1)。PCR反應(yīng)體系為25 μl:PCR Master Mix(2 × )12.5 μl，Nuclear-free Water 10 μl，引物各0.5 μl，cDNA 模板 2 μl。PCR 反應(yīng)條件:94℃ 預(yù)變性 2.5 min，94℃變性 40 s，60℃退火 40 s，72℃延伸40 s，共進(jìn)行 35個(gè)循環(huán)，最后 72℃延伸 10 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)紫外照相掃描分析。以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參基因進(jìn)行半定量分析(Tab 1)。

1.2.4 免疫細(xì)胞化學(xué)測定細(xì)胞FOLRα、P-gp的表達(dá)水平 MCF-7及 MCF-7/ADR細(xì)胞以5×107·L-1爬片，接種后待細(xì)胞密度為70%左右，用體積分?jǐn)?shù)為4%多聚甲醛4℃固定30 min，室溫下山羊血清封閉液封閉20 min，除去封閉液，一抗4℃反應(yīng)過夜。一抗分別為抗FOLRα、抗p-gp(均為1∶100稀釋)的兔多克隆抗體。4℃冰箱過夜，二抗37℃培養(yǎng)30 min，DAB顯色，蘇木精對比染色，鹽酸乙醇風(fēng)化，中性樹膠封固。每步均用pH=7.4，0.01 mol·L-1PBS沖洗3～4次，每次3～5 min。結(jié)果判定:細(xì)胞膜或胞質(zhì)著黃棕色顆粒為陽性細(xì)胞。結(jié)果采用Ver 3.00程序軟件分析，每張爬片隨機(jī)選取5個(gè)視野，測定陽性面積占視野面積的比例，以各組均值進(jìn)行比較。

1.2.5 MTT比色法測定甲氨蝶啶對MCF-7/ADR的逆轉(zhuǎn)作用 確定逆轉(zhuǎn)的藥物濃度:收集對數(shù)生長期MCF-7和MCF-7/ADR的細(xì)胞，同上MTT法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，設(shè)置二氫葉酸還原酶抑制劑甲氨蝶啶(MTX)濃度分別為 0.5、1、2、4、8、16、32 μmol·L-1計(jì)算各濃度對MCF-7細(xì)胞和MCF-7/ADR細(xì)胞的增殖抑制率，繪制細(xì)胞增殖抑制曲線，選取抑制率≤20%的低細(xì)胞毒性MTX濃度作為耐藥逆轉(zhuǎn)濃度。

耐藥逆轉(zhuǎn)倍數(shù)的測定:實(shí)驗(yàn)設(shè)3組:① 空白對照組;② ADR組(ADR濃度同實(shí)驗(yàn)方法“1.2.2”);③無毒劑量MTX+ADR(ADR濃度同實(shí)驗(yàn)方法“1.2.2”)組，以上過程均重復(fù)3次。逆轉(zhuǎn)倍數(shù)按以下公式計(jì)算:逆轉(zhuǎn)倍數(shù)=IC50A/IC50B(其中IC50A為ADR組的IC50值，IC50B為MTX+ADM組的IC50值)。

2 結(jié)果

2.1 MCF-7和MCF-7/ADR細(xì)胞生長曲線 通過對兩細(xì)胞株生長增殖曲線(Fig 1)進(jìn)行比較，敏感細(xì)胞MCF-7群體倍增時(shí)間為(24.5±2.5)h，耐藥細(xì)胞MCF-7/ADR群體倍增時(shí)間為(30.6±2.7)h，兩者比較差異有顯著性［5］(P ＜0.05)。

Fig 1 The growth curve of MCF-7 and MCF-7/ADR cells

2.2 MCF-7/ADR對ADR的耐藥倍數(shù)的測定MTT比色法顯示MCF-7/ADR細(xì)胞對ADM有較強(qiáng)耐藥性，ADM濃度在8 μmol·L-1及以下時(shí)細(xì)胞生長與對照組比較差異無顯著性，其IC50為(35.4±1.82)μmol·L-1;MCF-7細(xì)胞對ADM敏感，其IC50為(1.66 ±0.31)μmol·L-1，MCF-7/ADR 對 ADR的耐藥倍數(shù)約為22.5倍。

2.3 MCF-7和MCF-7/ADR細(xì)胞FOLRα、DHFR的mRNA的轉(zhuǎn)錄水平 我們分別測定了MCF-7和MCF-7/ADR細(xì)胞 FOLRα、DHFR的 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平(Fig 2)，半定量結(jié)果(Tab 2)顯示MCF-7細(xì)胞FOLRα mRNA轉(zhuǎn)錄水平較MCF-7/ADR葉酸受體mRNA轉(zhuǎn)錄水平高，而MCF-7/ADR細(xì)胞DHFR的mRNA的轉(zhuǎn)錄水平比MCF-7細(xì)胞高。

Fig 2 The transcriptional level of MCF-7/S cells and MCF-7/ADR cellsM:Marker;1:MCF-7 FOLRα;2:MCF-7/ADR FOLRα;3:MCF-7 DHFR;4:MCF-7/ADR DHFR

Tab 2 The mRNA expression of FOLRα and DHFR in MCF-7 and MCF-7/ADR cells±s，n=5)

*P＜0.05 vs MCF-7

Group FOLRα/GAPDH DHFR/GAPDH MCF-7 0.89±0.13 0.41±0.10 MCF-7/ADR 0.43±0.11* 0.72±0.11*

2.4 FOLRα、P-gp在 MCF-7和 MCF-7/ADR 細(xì)胞中的表達(dá) 高倍鏡下(Fig 3)P-gp主要分布于細(xì)胞質(zhì)上，細(xì)胞膜上有少量分布;FOLRα主要分布于細(xì)胞膜上，細(xì)胞質(zhì)中也有少量分布。MCF-7和MCF-7/ADR細(xì)胞比較(Tab 3)，MCF-7/ADR細(xì)胞P-gp表達(dá)量高于MCF-7細(xì)胞，而MCF-7/ADR細(xì)胞FOLRα表達(dá)量低于MCF-7細(xì)胞。

Tab 3 The expression of P-gp and FOLRα in MCF-7 and MCF-7/ADR cells(±s，n=5)

*P＜0.05 vs MCF-7

Group P-gp staining area proportion FOLRα staining area proportion MCF-7 cells 0.51±0.11 0.21±0.05 MCF-7/ADR cells 0.19±0.05* 0.12±0.04*

2.5 MTX對MCF-7/ADR細(xì)胞的抑制作用 不同濃度MTX作用48 h后，MTX對MCF-7、MCF-7/ADR細(xì)胞有抑制作用且成劑量依賴性(Fig 4)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，MTX對MCF-7、MCF-7/ADR細(xì)胞抑制作用差異無顯著性(P＞0.1)。

Fig 4 Inhibitory effect curve of MTX on MCF-7 and MCF-7/ADR cells

MTX 濃度為1 μmol·L-1時(shí)對 MCF-7/ADR 細(xì)胞的增殖抑制率為(16.3±5.1)%，選擇濃度為MTX耐藥逆轉(zhuǎn)濃度，結(jié)果顯示對MCF-7/ADR細(xì)胞多藥耐藥有逆轉(zhuǎn)作用，無毒劑量MTX+ADR組IC50時(shí)的ADR的濃度為(5.6±2.65)μmol·L-1，ADR組 IC50時(shí)的濃度為(34.9 ±2.53)μmol·L-1，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為6.3。

3 討論

腫瘤多藥耐藥是多種機(jī)制共同作用的結(jié)果，膜糖蛋白介導(dǎo)的藥物外排機(jī)制、細(xì)胞內(nèi)解毒物質(zhì)活性增強(qiáng)、細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)與突變、腫瘤細(xì)胞損傷后自我修復(fù)能力增強(qiáng)及其腫瘤干細(xì)胞的存在［6］等因素是腫瘤多藥耐藥重要的機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)與王玲等［4］都證實(shí)P-gp表達(dá)增強(qiáng)是MCF-7/ADR細(xì)胞多藥耐藥的重要機(jī)制。

葉酸受體是一種糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨定膜蛋白，可介導(dǎo)細(xì)胞外葉酸進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)［7］，是目前抗腫瘤治療研究的重要靶點(diǎn)［8］，目前已鑒定出α-FR、β-FR、γ-FR 3種亞型，F(xiàn)R特別是FOLRα在正常細(xì)胞中少量表達(dá)或不表達(dá)，但在許多腫瘤細(xì)胞中存在過度表達(dá)，如卵巢癌、乳腺癌、腎癌、結(jié)直腸癌、肺癌、睪丸癌、室鼓膜瘤和脈絡(luò)膜瘤等［1，9］。葉酸受體介導(dǎo)細(xì)胞外葉酸進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，它的表達(dá)水平與腫瘤進(jìn)展及細(xì)胞增殖相關(guān)［10］。本實(shí)驗(yàn)RT-PCR及免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果均證實(shí)MCF-7細(xì)胞葉酸受體表達(dá)水平較MCF-7/ADR細(xì)胞高，可能原因與MCF-7細(xì)胞增殖速度較MCF-7/ADR細(xì)胞快［5］，對葉酸的需求量較大有關(guān)［10］，與耐藥的具體關(guān)系還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

DHFR可催化FH2轉(zhuǎn)化為FH4，F(xiàn)H4作為體內(nèi)一碳單位轉(zhuǎn)移載體，參與體內(nèi)同型半胱氨酸(Hcy)轉(zhuǎn)變?yōu)榧琢虬彼徇^程，參與體內(nèi)核苷酸(dTMP)合成，與 DNA生物合成及損傷修復(fù)相關(guān)。MTX是DHFR抑制劑，是臨床乳腺癌化療常用藥物之一。實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)MCF-7/ADR細(xì)胞DHFR的mRNA的轉(zhuǎn)錄水平比MCF-7細(xì)胞高，MTX能逆轉(zhuǎn)MCF-7/ADR細(xì)胞的多藥耐藥，說明DHFR可能參與ADR對細(xì)胞DNA損傷的修復(fù)作用，與MCF-7/ADR細(xì)胞的MDR可能存在相關(guān)性;另外我們發(fā)現(xiàn)MCF-7/ADR細(xì)胞對 MTX敏感［11］，其原因可能在于:①ADR誘導(dǎo)細(xì)胞MDR與MTX誘導(dǎo)的細(xì)胞耐藥在機(jī)制上存在差別;②有報(bào)道MCF-7/ADR細(xì)胞與親代細(xì)胞相比較，S期細(xì)胞增多，G1期細(xì)胞減少［5］，而MTX則特異性作用于S期。

總之MCF-7/ADR細(xì)胞FOLRα的表達(dá)水平下調(diào)，與細(xì)胞增殖水平有關(guān)，其下游基因DHFR表達(dá)水平與MCF-7/ADR細(xì)胞的MDR可能存在相關(guān)性。由于MTX能逆轉(zhuǎn)MCF-7/ADR細(xì)胞的多藥耐藥，因此MTX+ADR組合方案在乳腺癌化療方案有可行之處。

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