內嗎啡肽在小鼠樹突狀細胞的誘導表達

李正紅，高 琴，葉紅偉，單立冬，龔 珊，蔣星紅

樹突狀細胞(dendritic cells，DC)是目前發現的功能最強大的專職抗原遞呈細胞(antigen presenting cells，APC)，參與抗原的攝取、加工及提呈。DC最大的特點是能夠顯著刺激處女型或初始型T細胞(naive T cells)增殖，因此DC是機體免疫反應的始動者，在誘導免疫應答過程中具有獨特的地位。DC除了單純的抗原捕獲、遞呈和對T細胞的協同刺激作用外，在特異性激活幼稚T細胞、聯結天然免疫和獲得性免疫反應中也起著獨一無二的作用。

內嗎啡肽(endomorphin，EM)是新發現的一種阿片樣四肽。EM有兩種:內嗎啡肽-l(endomorphinl，EM-1，Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2)和內嗎啡肽-2(endomorphin-2，EM-2，Tyr-Pro-Phe-Phe-NH2)。它們有特異性的結構，比其他的阿片肽如腦啡肽，對酶的分解作用有更強的耐受性，與Mu阿片受體有更高的親和力，被認為是 Mu阿片受體的內源性配體［1］。EM-1和EM-2廣泛分布于中樞神經系統富含Mu受體的神經元，并參與鎮痛［2，17］。

近年來，越來越多的研究表明，內源性阿片肽能在免疫細胞中生成，是細胞免疫應答的有力調控因素。在關節炎大鼠后爪分泌滑液的組織中［3］和在炎癥大鼠的炎癥爪局部組織及淋巴結中［4］，均發現EM-1和EM-2的水平有所升高，并且伴有Mu受體的高表達［3－4］。EM-1和 EM-2在外周免疫細胞的巨噬細胞/單核細胞中都有表達［5］，并且通過抑制致炎細胞因子的產生來改變鼠腹腔巨噬細胞的功能［6－8］。盡管有很多的證據提示DC在免疫反應中的作用，但DC是否產生內嗎啡肽，國內外尚未見報道。本研究應用免疫熒光染色觀察EM-1和EM-2是否在樹突狀細胞表達，并進一步研究不同的Toll樣受體的配體對樹突狀細胞分泌EM的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑 鼠源集落刺激因子(Pepro-Tech，Rocky Hill，NJ);CD11+ 磁珠(Miltenyi Biotech，Bergish-Gladbach，Germany);Alexa Fluor 488 or Alexa Fluor 546標記的二抗(both from Invitrogen，CA，USA);Zeiss LSM 510 共聚焦顯微鏡;12.5 mg·L－1poly(I∶C)，6 mg·L－1CpGODN，1 mg·L－1Pam3Cys(all from InvivoGen，San Diego，CA);1 mg· L－1LPS (lipopolysacchairde，脂 多 糖，Sigma Aldrich，St Louis，MO);抗EM-1多克隆的抗體 (1∶200)和抗 EM-2多克隆的抗體(1∶100)，購自Chemicon，USA。抗 CD11c的單克隆抗體(1∶30;clone:HL3)來源于BD-Pharmingen。EIA試劑盒購自Phoenix Pharmaceuticals Inc。

1.1.2 實驗動物 C57BL/6J♀鼠購自北京協和醫科大學實驗動物研究所。

1.2 方法

1.2.1 骨髓來源的 DC的制備與培養 用 Inaba等［16］的方法來培養大量的DC，略作改動。將7～8周齡的正常C57BL/6J鼠頸椎脫位處死，無菌條件下取完整的股骨、脛骨，剔凈周圍組織，離斷干骺端后，用皮試針抽吸RPMI 1640培養液沖洗髓腔，獲得單細胞懸液;1 500 r·min－1離心10 min，棄上清后加入適量Tris-NH4Cl破解紅細胞，再用PBS洗滌兩次后用含10 μg·L－1GM-CSF、體積分數10%胎牛血清的RPMI 1640培養液重懸細胞，種于6孔板，接種密度為1×109～2 ×109·L－1(3 ～4 ml)·well－1。d 3，輕輕吸棄未貼壁細胞、全量換液。d 5，吸棄半量培養基，并補充該量。d 6、7，收集懸浮和半貼壁細胞。

采用CD11c免疫磁珠進行磁性分選純化樹突狀細胞。用 20 mmol·L－1PBS(0.15%BSA，pH 7.12)洗滌細胞兩次，加入CD11c免疫磁珠，4℃反應20 min，離心洗滌后將細胞懸液加入MS磁分離柱中進行分離純化，獲取CD11c+的骨髓來源的樹突狀細胞，所有操作根據autoMACS系統的廠商說明書進行 (Miltenyi Biotech，Bergish-Gladbach，Germany)。采用PE標記的倉鼠抗小鼠CD11c mAb，通過流式細胞儀(Florescence-activated cell sorting，FACS)分析純化前后的DC純度。

1.2.2 免疫熒光染色 迄今為止，EM及其前體肽的核苷酸序列仍未知，因此用免疫熒光的方法檢測它們在DC的產生。采用的抗EM的抗體，系兔抗鼠的多克隆抗體，其特異性已被其他研究［4］所證明。抗EM-1和抗EM-2的抗體與其他的阿片肽(如內啡肽和腦啡肽)之間都沒有交叉反應性。在多重的切片中，染色的特異性用一抗或二抗的省略所證實。在這些陰性對照的實驗中，沒有陽性染色的結果。

為了證實在DC上的EM-1/EM-2的表達，在4孔培養板中培養的DC用雙重的免疫熒光技術進行染色，共聚焦顯微鏡觀察。成熟和未成熟的DC載玻片用丙酮固定，隨后加入抗EM-1和抗EM-2的多克隆抗體和抗CD11c的單抗進行免疫染色，4℃過夜孵育。洗去一抗后，加入相應的Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 546標記的二抗，在室溫下孵育1 h。陰性對照包括:省略一抗，省略二抗和同型對照。

1.2.3 TLR配體影響EMs的分泌 由于TLR配體可以促進DC的成熟［19］，并且導致致炎細胞因子的釋放，推測TLR配體可能影響EM的產生。培養7 d的DC，進行純化。純化后的DC以5×105細胞/毫升的濃度培養于48孔培養板中，并且用以下條件來刺激:12.5 mg·L－1poly(I∶C);6 mg·L－1CpG ODN;1 mg·L－1Pam3Cys;1 mg·L－1LPS。細胞培養24 h后，分別收集各孔細胞和培養上清液，檢測其EM-1和EM-2的分泌水平。未刺激的DC作為對照。

1.2.4 Enzyme immunoassay(EIA)檢測 EM 采用EIA方法檢測EMs。本試劑盒采用競爭結合的方法來間接測得EM的濃度。簡言之，可識別一抗的二抗預先包被在微量檢測板上，反應體系中包括可識別EM的一抗和固定濃度的生物素標記的EM。當加入含EM的樣本或EM標準品時，這些未標記的EM與生物素標記的EM競爭結合一抗，經過嚴格的洗脫，將形成抗原－抗體復合物，包括EM－生物素標記EM－一抗－二抗，由于鏈親和素(streptavidin)可與生物素以較高的親和力結合，因此加入鏈親和素標記的辣根過氧化物酶(SA-HRP)后，可以通過顏色的深淺來間接反映樣本中的EM濃度。

每孔加入50 μl的待測樣本或標準品，25 μl的一抗以及25 μl的生物素標記的EM;室溫孵育2 h后，洗脫5次;加入100 μl的鏈親和素標記的辣根過氧化物酶，室溫孵育1 h;洗脫6次;加入100 μl的底物，室溫孵育 1 h;用 100 μl的 2 mol·L－1HCl終止反應;用OD450nm讀取光吸收值，并計算結果。

1.3 統計學分析 Mann-Whitney U test用于比較不同試驗組的差異。

2 結果

2.1 樹突狀細胞產生EM CD11c分子系DC的表面膜分子，當用Alexa544標記的二抗進行免疫熒光染色時，DC的細胞膜呈紅色。細胞在細胞質內合成EM的前體，并分泌產生EM，因此，當用Alexa 488標記的二抗進行免疫熒光染色時，DC的胞質呈綠色。我們的結果，如Fig 1A所示，說明了EM-1的免疫反應性可以在活化的CD11c+DC的細胞質中被檢測到，活化的CD11c+DC具有樹突消失和圓形的形態學特性。此外，EM-2的免疫反應性也可以在活化的CD11c+DC中被檢測到(如Fig 1B)。在未活化的樹突狀細胞，EM-1和EM-2陽性細胞較少，當用LPS刺激活化后，EM陽性細胞增加，表明了EM-1和EM-2在DC中可以被誘導性表達。

2.2 TLR配體影響EMs的分泌 免疫磁珠分選的CD11c+細胞，培養在48孔板中，加入不同的TLR配體刺激細胞24 h。收集細胞培養上清液，用EIA試劑盒測量培養上清液中的EM-1和EM-2的濃度。未刺激活化的細胞作為對照。結果表明，用TLR配體刺激活化的樹突狀細胞，與對照組相比，都能使上清液中EM濃度明顯升高。其中，LPS和poly(I∶C)促進EM分泌的效果更加明顯，而且不同的TLR配體促進EM-1和EM-2分泌的效果相似(Fig 2)。

Fig 1 Confocal microscopic pictures of endomorphin expression on DCDouble fluorescence staining showed the co-expression of EM-1(A)or EM-2(B)with CD11c in DC.DCs were activated by LPS for 24 h.Resting DCs were not activated by LPS.d，e，f.:co-expression of endomorphin-1 or endomorphin-2(green)with CD11c+dendritic cells(red)was detected in LPS-activated group;Inset at the left corner of(f)showing co-expression of EM and CD11c in dendritic cell(indicated by arrow)with high magnification.a，b，c:no co-expression of EM with CD11c was detected in non-activated，resting DCs，although a few EMs-positive cells(indicated by arrows)were observed.Control omitting primary antibody against EM

3 討論

在炎癥條件下，多種類型的免疫細胞可以在原位或在其培養物中檢測到具有阿片活性的肽類，表明免疫細胞能產生阿片類物質。近年來，相繼有報道EMs和Mu受體在不同免疫細胞中表達。例如，在活化的CD4+/CD8+T細胞和B細胞中，Mu受體表達上調［9］，在腘淋巴結的髓質區［4］和脾臟［5］中，在巨噬細胞/單核細胞和B細胞中都能檢測到EM-1和EM-2。在人體和小鼠的DC都有Mu受體的表達［10］。本研究表明，來源于骨髓的DC，經LPS活化后，能檢測到EM-1/EM-2的表達。

Fig 2 Secretion of endomorphins from TLR ligands-treated DCsThe concentration of EMs in supernatant was measured using enzyme immunoassay kit.Non-activated DCs were used as control.Data were calculated from triplicate independent experiments.A:Concentration of EM-1 released from DCs in the presence of TLR ligands.B:Concentration of EM-2 released from DCs in the presence of TLR ligands.*P ＜ 0.05，＊＊P＜0.01 vs control

研究發現［18］，TLR存在于 APC(抗原遞呈細胞)、B細胞、巨噬細胞及其他細胞的細胞膜上，而且都有一個胞外的富亮氨酸的重復區域和一個介導信號轉導的胞質區。實驗中用骨髓來源的DC進行離體培養，是為了模擬體內DC成熟的條件，采用不同的Toll樣受體的配體進行活化，TLR配體可能影響EM的產生。DC膜上的Toll樣受體能感應微生物的產物［11－12］導致致炎因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)的表達，誘發局部免疫應答反應［13，19］。實驗結果表明，EM-1和EM-2不僅在DC的胞質內表達，而且在培養DC的上清液中也測得到EM-1和EM-2，表明DC不僅能產生EMs，而且還能分泌到周圍環境中，至于EMs產生的機制還不太清楚。根據肽類物質生成的一般規律，可能是從前體肽類降解而來，而Toll樣受體信號可能參與了調控。

實驗結果顯示DC生成的EMs能分泌到上清液中，這提示DC可以作為免疫調節因素，使EMs作用于鄰近的其他細胞，發揮免疫調節作用。由于DC自身也表達Mu受體［10］。因此，DC分泌的 EMs有可能作用于自身的Mu受體，以自分泌和旁分泌的方式發揮免疫調節作用。事實上，阿片肽也被認為是細胞因子家族的成員，在神經組織和非神經組織中發揮調控作用［14］。

在DC上發現有EMs和Mu受體的誘導性表達，具有重要的生物學意義。設想在炎癥早期，DC的滲入和參與，胞質中的蛋白前體在Toll樣受體的配體作用下生成EMs。隨著DC的成熟，可以遷移至外周免疫組織和一些特異的器官(如發炎的滑膜組織)，在組織中，EM-1和EM-2被轉運和釋放，作用于鄰近的其他細胞。成熟的DC提供給T細胞的，不僅是抗原特異性的刺激信號和一系列的共刺激的分子，也釋放了一些可以使T細胞分化的細胞因子和其他化學因子。除了T細胞，釋放的EM-1和EM-2也可以作用在巨噬細胞，抑制促炎介質的釋放，例如，IL-2、IL-12、腫瘤壞死因子(TNF-α)［7］。總之，我們可以合理的推測，DC釋放的 EM-1和EM-2可以調節先天的和適應性的免疫應答。此外，DC可以遷移至有炎癥的組織，DC分泌的EM-1和EM-2可以作用在初級傳入的傷害性神經元的末端，通過抑制P物質和降鈣素基因相關肽的產生來發揮強效的鎮痛效應，或者調節小膠質細胞的功能［15］。

總之，在CD11c陽性的DC中EM-1、EM-2的誘導性表達，擴展了我們對于免疫系統內阿片肽在細胞內分布的認識，也提示了它們在調控神經內分泌免疫調制和鎮痛方面的作用。

［1］Zadina J E，Hackler L，Ge J，et al.A potent and selective endogenous agonist for the mu-opiate receptor［J］.Nature，1997，386(6624):499－502.

［2］Fichna J，Janecka A，Costentin J，et al.The endomorphin system and its evolving neurophysiological role［J］.Pharmacol Rev，2007，59(1):88－123.

［3］Jessop D S，Richards L J，Harbuz M S.Opioid peptides endomorphin-1 and endomorphin-2 in the immune system in humans and in a rodent model of inflammation［J］.Ann NY Acad Sci，2002，966:456－63.

［4］Mousa S A，Machelska H，Schafe M，et al.Immunohistochemical localization of endomorphin-1 and endomorphin-2 in immune cells and spinal cord in a model of inflammatory pain［J］.J Neuroimmunol，2002，126(1 －2):5 －15.

［5］Seale J V，Jessop D S，Harbu M S.Immunohistochemical staining of endomorphin 1 and 2 in the immune cells of the spleen［J］.Peptides，2004，25(1):91 －4.

［6］Inui Y，Azuma Y，Ohura K.Differential alteration of functions of rat peritoneal macrophages responsive to endogenous opioid peptide endomorphin-1［J］.Int Immunopharmacol，2002，2(8):1133 －42.

［7］Azuma Y，Ohura K.Endomorphin-2 modulates productions of TNF-alpha，IL-1beta，IL-10，and IL-12，and alters functions related to innate immune of macrophages［J］.Inflammation，2002，26(5):223－32.

［8］Azuma Y，Ohura K.Endomorphins 1 and 2 inhibit IL-10 and IL-12 production and innate immune functions，and potentiate NF-kappaB DNA binding in THP-1 differentiated to macrophage-like cells［J］.Scand J Immunol，2002，56(3):260 －9.

［9］Gaveriaux-Ruff C，Matthes H W，Peluso J，et al.Abolition of morphine-immunosuppression in mice lacking the mu-opioid receptor gene［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1998，95(11):6326 －30.

［10］Makarenkova V P，Esche C，Kost N V，et al.Identification of deltaand mu-type opioid receptors on human and murine dendritic cells［J］.J Neuroimmunol，2001，117(1 －2):68 －77.

［11］Akira S.Immunological mechanism in man against infection［J］.Nippon Naika Gakkai Zasshi，2001，90(12):2360 －5.

［12］Iwasaki A，Medzhitov R.Toll-like receptor control of the adaptive immune responses［J］.Nat Immunol，2004，5(10):987 － 95.

［13］Lehnardt S，Massillon L，Follett P，et al.Activation of innate immunity in the CNS triggers neurodegeneration through a Toll-like receptor 4-dependent pathway［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2003，100(14):8514－9.

［14］Sharp B M，Roy S，Bidlack J M.Evidence for opioid receptors on cells involved in host defense and the immune system［J］.J Neuroimmunol，1998，83(1 －2):45 －56.

［15］Azuma Y，Ohura K，Wang P L，et al.Endomorphins 1 and 2 modulate chemotaxis，phagocytosis and superoxide anion production by microglia［J］.J Neuroimmunol，2001，119(1):51 －6.

［16］Inaba K，Inaba M，Romani N，et al.Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor［J］.J Exp Med，1992，176(6):1693 －702.

［17］任維華，霍笑風，吳 寧，等.內嗎啡肽研究進展［J］.中國藥理學通報，2001，17(1):17 －20.

［17］Ren W H，Huo X F，Wu N，et al.Progress in the studies of endomorphins［J］.Chin Pharmacol Bull，2001，17(1):17 －20.

［18］葉 紅，余味一.藥用真菌葡聚糖免疫調節作用的研究進展［J］.中國藥理學通報，2009，25(2):153 －6.

［18］Ye H，Yu W Y.Progress on the study of the immunomodulating action of glucans from macrofungi［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25(2):153－6.

［19］劉道芳，魏 偉，宋禮華.TLRs介導的免疫調節信號通路及其藥物作用［J］.中國藥理學通報，2005，21(6):653 －6.

［19］Liu D F，Wei W，Song L H.Immunoregulation signal pathway mediated by TLRs and its drug role［J］.Chin Pharmacol Bull，2005，21(6):653－6.