褪黑素對HeLa細胞的生長及NF-κB蛋白表達的影響

陳少雅，陳崇宏，楊麗娟，林 菁

褪黑素(melatonin，MT)是生物體內普遍存在的一種吲哚類激素，在人體內主要由松果體合成和分泌。大量研究表明，MT具有鎮痛、鎮靜、調整時差、抗氧化、免疫增強、抗腫瘤［1］等作用，且相對安全。在抗腫瘤及腫瘤輔助治療方面存在理論價值和應用前景。目前，中、晚期宮頸癌位居十大高死亡率惡性腫瘤之列。宮頸癌術后必須進行化療，有臨床研究表明［2］宮頸癌患者血漿中MT水平較正常人低，故MT用于宮頸癌治療具備可能性。然而，國外已有的MT對HeLa細胞抑制作用的研究結果存在爭議［3］。MT抗腫瘤的機制目前仍不清楚。NF-κB在HeLa細胞中高表達，對腫瘤的發生、發展發揮重要作用，是腫瘤預防和治療的潛在靶點［4］。因此，本研究旨在對MT抗HeLa細胞增殖活性作進一步探討，并探究其與NF-κB蛋白表達的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 人宮頸癌HeLa細胞購于上海中國科學院細胞庫。

1.1.2 藥品及試劑 MT，Sigma公司產品;RPMI 1640培養基干粉，Hyclone產品;胰蛋白酶為Difco進口分裝;小牛血清，杭州四季青生物試劑公司產品;碘化丙啶(PI)，吖啶橙(AO)，溴化乙錠(EB)，四甲基偶氮唑鹽(MTT)為Sigma公司產品;其余試劑均為分析純產品;anti-NF-κB小鼠單抗;anti-β-actin山羊單抗;辣根酶標記兔抗山羊IgG、堿磷酶標記馬抗小鼠IgG、堿磷酶標記山羊抗兔IgG，均為Santa Cruz產品;堿性磷酸酶(AP)顯色底物為進口分裝。

1.2 方法

1.2.1 MTT法檢測細胞體外增殖抑制試驗 取對數生長期的HeLa細胞，以0.25%胰蛋白酶充分消化后，以培養基配成適當濃度接種于96孔培養板中，180 μl/孔，實驗組加入等體積不同濃度的藥物20 μl/孔(終濃度分別為 0.008、0.04、0.2 及 1 g·L-1)，對照組加入等體積培養液。每組設4個復孔。在藥液分別作用1～5 d后，每天取1塊培養板，加入5 g·L-1MTT 20 μl/孔終止藥物作用，在培養箱中繼續孵育4 h后，棄凈上清液，加DMSO 150 μl/孔，空白對照孔只加入 DMSO 150 μl/孔，振蕩10 min，492 nm波長下用酶標儀測定光吸收值(OD492)。直線回歸法計算IC50。

1.2.2 AO和EB雙染熒光顯微鏡觀察MT對HeLa細胞形態學的影響 取對數生長期HeLa細胞，2.5 g·L-1胰蛋白酶消化，離心，全培養基稀釋成5×107·L-1接種于6孔培養板，待細胞貼壁后加入MT使每孔細胞終濃度為200 mg·L-1，對照組加入等體積含10 ml·L-1無水乙醇的培養液，分別孵育1、2及3 d后，2.5 g·L-1胰蛋白酶消化，離心收集細胞，用PBS洗滌兩次后，稀釋成1010·L-1細胞懸液，取10 μl細胞懸液與1 μl AO 和1 μl EB 混合(AO、EB終濃度均為4 mg·L-1)，滴于載玻片上，用熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.2.3 Western blot法檢測NF-κB蛋白水平 取對數生長期的HeLa細胞分別以全培養基及含MT(終濃度為0.008、0.04、0.2 g·L-1)培養基孵育 1、2 及3 d，收集不同時間點的細胞，用去污裂解液裂解各組細胞，提取總蛋白，用考馬斯亮藍法測各組蛋白濃度，制備100 g·L-1SDS-PAGE，每泳道加總蛋白90 μg，進行電泳，轉膜，麗春紅-S 染色，50 g·L-1BSATBST常溫下封閉過夜后，分別加入anti-NF-κB小鼠單抗(一抗)、anti-β-actin山羊單抗反應2 h，PBS漂洗2次，TBST漂洗1次，分別加入堿磷酶標記馬抗小鼠IgG(二抗)、辣根酶標記兔抗山羊IgG反應1 h，TBST漂洗3次，分別用AP、DAB顯色底物(避光反應)，NC膜上顯色至出現清晰的條帶，立即終止顯色，洗膜，晾干，拍照，膜永久保存。用 Gel-Pro Analyzer分析軟件分析通道蛋白的灰度，相對含量用 NF-κB/β-actin灰度值比表示。

2 結果

2.1 MT對HeLa細胞的抗增殖活性 HeLa細胞的生長曲線顯示，隨著MT劑量的增加，作用時間的延長，抑制增殖作用明顯增強，生長曲線隨之下移。MT作用3 d，抑制 HeLa細胞的 IC50為61.71 mg·L-1(Fig 1)。

2.2 AO和EB雙染熒光顯微鏡觀察MT對HeLa細胞形態學的影響 熒光顯微鏡下，對照組經胰酶消化的HeLa細胞呈圓形(Fig 2A);MT 1 g·L-1作用1、2、3 d組，胞膜溶解的壞死細胞隨作用時間的延長而逐漸增多，凋亡細胞少見(Fig 2B、C、D)。由此可見，MT主要致HeLa細胞壞死而少致凋亡。

2.3 MT對HeLa細胞NF-κB蛋白水平的影響MT 0.2 g·L-1作用 1、2、3 d，對 HeLa 細胞 NF-κB蛋白水平的抑制作用呈明顯的時間依賴性。作用時間越長，抑制作用越明顯。MT 0.2 g·L-1作用1、2、3 d NF-κB蛋白水平明顯抑制，與對照組比較，P＜0.01;MT 0.2 g·L-1作用2及3 d較作用1 d的NF-κB蛋白水平低，MT 0.2 g·L-1作用3 d較作用2 d的 NF-κB 蛋白水平低，P ＜0.01(Fig 3)。

MT 0.008、0.04 及 0.2 g·L-1作用 3 d，對 He-La細胞NF-κB蛋白水平的抑制作用呈明顯的濃度依賴性。MT 0.008、0.04及0.2 g·L-1作用3 d對NF-κB蛋白水平的抑制作用明顯，與對照組比較，P＜0.01;MT 0.04 及0.2 g·L-1較 MT 0.008 g·L-1組對NF-κB蛋白水平的抑制作用明顯，P＜0.01;MT 0.2 g·L-1較 MT 0.04 g·L-1對 NF-κB 蛋白水平的抑制作用明顯，P＜0.01(Fig 4)。

Fig 1 Inhibiting activity of melatonin on HeLa cells by MTT assay( ± s，n=5)MT1:Treated with MT 8 mg·L-1;MT2:With 40 mg·L-1;MT3:With 200 mg·L-1;MT4:With 1 g·L-1

Fig 2 Morphological alterations of HeLa cells stained with AO/EB by fluorescene staining(×400)A:Control;B:Treated with melatonin 1 g·L-1for 1 d;C:for 2 d and D for 3 d.→，necrosis cells

3 討論

MT作為幾無毒性的內源性激素，其抗腫瘤活性及應用前景已引起廣泛關注。國內外報道［5-7］多顯示MT對體內、外腫瘤有抑制增殖作用。在多種體外培養腫瘤細胞株上，多家實驗室均觀察到MT可抑制腫瘤細胞的增殖，但有關抗腫瘤活性的有效劑量報道不一［3］，可能與體外培養腫瘤細胞系的類別、給藥時間、藥物的溶解度等實驗條件不同有關。本課題組前期工作顯示MT對體外培養HeLa細胞系有抑制增殖作用，且主要表現為細胞壞死，壞死程度呈劑量依賴性，未見明顯的細胞凋亡。由此可見，MT抑制HeLa細胞增殖是導致細胞壞死為主而非促發細胞凋亡。

Fig 3 The influences of melatonin on NF-κB levels on HeLa cells by Western blot analysis(±s，n=5)Group 1，treated with MT 0.2 g·L-1for 1 d;Group 2 for 2 d;Group 3 for 3 d.NF-κB/Relative densities，＊＊P ＜0.01 vs control;△△P＜0.01 vs group 1;○○P ＜0.01 vs group 2

Fig 4 The influences of melatonin on NF-κB levels on HeLa cells by Western blot analysis(±s，n=5)MT1:Treated with MT 0.008 g·L-1;MT2:With 0.04 g·L-1;MT3:With 0.2 g·L-1.NF-κB/Relative densities，＊＊P ＜ 0.01 vs control，△△P ＜0.01 vs MT1，○○P ＜0.01 vs MT2

MT的抗腫瘤作用機制廣泛而復雜［8-10］，目前主要的觀點包括抗氧化作用、免疫調節作用、對細胞代謝及細胞周期的影響，調節生長因子，干擾鈣調素和微管蛋白的功能，作用于MT1受體調節多種基因表達等。有報道表明，MT通過抑制NF-κB活性而增強TNF-α所致的腫瘤細胞死亡［11］;皮質酮抑制NF-κB來調制NA誘導的MT合成［12］。MT對HeLa細胞中高表達的NF-κB是否有影響未見相關報道。

NF-κB是廣泛存在于人體組織細胞中的轉錄因子，最常見的家族成員是p65/p50異源二聚體，對眾多基因發揮轉錄調節作用。NF-κB通常在胞質中與抑制蛋白 IκB 結合呈非活性狀態，IκB-α 對 NF-κB的活化起主要調控作用，NF-κB的活化主要依賴于IκB蛋白的磷酸化，而 IκB 蛋白的磷酸化在 IκB 激酶(主要為IκKβ)催化下進行。激活的NF-κB移位入胞核后可上調多種靶基因的表達，包括多種細胞因子的表達，與腫瘤的發生和發展［13］等密切相關。NF-κB在許多疾病發病機制中扮演關鍵角色［14-15］。有報道顯示［16］，NF-κB增高可促進腫瘤的增殖與轉移，并且導致腫瘤化療耐藥。NF-κB抑制劑已成為目前治療腫瘤的新策略。

鑒于MT和NF-κB作用及機制的復雜性、關聯性，為探究MT抑制HeLa細胞與NF-κB水平的關系，本研究采用Western blot法檢測不同濃度的MT對HeLa細胞 NF-κB的蛋白水平的影響。結果提示，MT 0.2 g·L-1作用 1、2 及 3 d，對 HeLa 細胞生長抑制的同時NF-κB蛋白水平下調，從MT作用2 d開始，呈時間依賴性。MT 0.008、0.04及0.2 g·L-1作用3 d，對HeLa細胞 NF-κB蛋白水平的下調呈明顯的濃度依賴性。說明MT對HeLa細胞的抗增殖活性與NF-κB蛋白水平的下調可能有關。與文獻報道［15］相符。NF-κB與細胞因子的關系復雜，細胞因子TNF-α可導致細胞凋亡和壞死，HeLa細胞的壞死可能與MT抑制NF-κB而增強TNF-α功能有關［11］，也可能是MT抗腫瘤的復雜機制共同導致。

綜上所述，MT抑制HeLa細胞增殖的機制復雜，下調 NF-κB水平可能與其抗腫瘤機制有關。NF-κB與其信號轉導通路上各個抑制環節的關系如何?MT造成HeLa細胞壞死與NF-κB下調影響細胞因子的作用是否關聯?有待下一步實驗驗證，為開發MT及其類似物和NF-κB抑制劑用于腫瘤化療及化療增敏方面提供理論基礎。

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