纖維素酶生產菌的篩選鑒定及其產酶影響因素研究*

李毅然 馬 亢

(商丘師范學院生命科學學院，河南 商丘 476000)

纖維素酶生產菌的篩選鑒定及其產酶影響因素研究*

李毅然 馬 亢

(商丘師范學院生命科學學院，河南 商丘 476000)

通過篩選從土壤和腐朽樹木中得到了4株纖維素酶高產菌株MF1、MF4、TF3和TF9，經初步鑒定分別是綠色木霉、青霉屬、康氏木霉和黑曲霉。通過對TF3發酵產酶的影響因素研究表明，其發酵產酶的最佳碳源是麩皮－纖維素粉復合物，最佳氮源是硫酸銨，最適發酵溫度范圍是30～32℃，最適初始pH范圍是6～7。

篩選;鑒定;纖維素酶;影響因素

當今，石油等不可再生能源日益消耗，自然界中大量的纖維素資源越來越受到人們的青睞。纖維素類物質自身所具備的可再生、廉價、豐富、分布廣、環保等特點，及其廣泛的用途，其價值不可估量［1，2］。而利用纖維素最有效的途徑是通過纖維素酶類進行生物降解，該途徑經濟、環保、快速。纖維素酶是指能夠對纖維素類物質進行降解并生成葡萄糖的一類酶的總稱，是幾種具有不同酶活力的酶復合物，主要包括外切纖維素酶、內切纖維素酶、β－葡萄糖苷酶等［3］。利用微生物產生的纖維素酶將纖維素轉化為食品、能源和化工材料，對解決人類所面臨的諸多問題具有極大的現實意義［4，5，6］。當前，阻礙人類廣泛高效地利用纖維素的瓶頸，仍然是缺少纖維素酶的高產菌，因此，篩選具有高活性纖維素酶的微生物菌株仍是該領域的研究熱點和難點之一。本實驗在參閱大量文獻和廣泛采樣的基礎上，分離到了4株纖維素酶活性較高的菌株，并對其產酶溫度和初始pH條件做了研究。

1.實驗材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 樣品采集

樣品采自于商丘市伐木場鋸末堆下土壤、森林公園腐朽樹木，將樣品置于實驗室進行自然風干，除去雜質，粉碎，過篩，然后裝入樣品袋待用。所用試劑藥品均為市售分析純。

1.1.2 培養基

富集培養基: (NH4)2SO41g，KH2PO42g，MgSO4·7H2O 0.3g，CaCl20.3 g，FeSO4·7H2O 5mg，CMCNa 5g，葡萄糖2.5g，蛋白質1g，蒸餾水1000ml。

篩選培養基:CMCNa 5 g，KCl 0.5g，KH2PO40.5g，MgSO4·7H2O 0.25g，FeSO4·7H2O 5mg，NaNO33g，剛果紅0.05g，蛋白胨1g，瓊脂粉15g，蒸餾水1000ml。

種子培養基:纖維素粉25g/L，麩皮20g/L，(NH4)2SO41.5g/L，KH2PO42g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，pH自然。

發酵培養基:CMC 7g/L，麩皮6g/L，(NH4)2SO42g/L，蛋白胨0.6g/L，吐溫 －80 1.5mL/L，KH2PO42g/L，CaCl20.3g/L，MgSO40.3g/L，Mn SO4·4 H2O 0.3 g/L，pH6。

基礎培養基:CMCNa 20g，KH2PO42g，(NH4)2SO42.5g，MgSO4·7H2O 0.3g，CaCl2·2 H2O 0.3g，FeSO4·7H2O 5mg，MnSO4·4 H2O 1.5mg，ZnSO4·7H2O 2mg，CoCl2·6 H2O 1.7mg，吐溫－80 1.5ml，蒸餾水1000ml，pH自然。

PDA培養基:馬鈴薯200g，蔗糖20g，水1000ml。

1.1.3 溶液配制

檸檬酸緩沖液:稱取7.16 g Na2HPO4，溶于蒸餾水中，定容至100ml，即為0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液;稱取2.1g檸檬酸，溶于蒸餾水中，定容至100ml，即為0.1mol/L檸檬酸溶液。取0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液24.3ml和檸檬酸溶液25.7ml混勻。

羧甲基纖維素鈉溶液:準確稱取羧甲基纖維素鈉2.0g，溶于200ml蒸餾水中，沸水浴中加熱至融化，過濾，取濾液150ml，加檸檬酸緩沖液30ml，蒸餾水60ml，混勻，置于冰箱中備用。

3，5—二硝基水楊酸顯色液［7］:按照文獻中提供的方法配制，貯存于棕色瓶中放置于冰箱中備用。

標準葡萄糖溶液配制:準確稱取已烘干的葡萄糖200.00mg，溶于蒸餾水中，定容至200.00ml。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種分離篩

取處理好的樣品10g放入裝有100mL無菌水和無菌玻璃珠的三角瓶中，振蕩10min后吸取上清液，將上清液接入富集培養基中進行富集培養;取富集培養液，按梯度稀釋到10－2，10－3，10－4，10－5，10－6，分別涂布到篩選平板培養基上，28℃培養 3 ～6d，挑取具有明顯水解圈的菌落進行純化，并將純化后的菌株用斜面保存于4℃冰箱中;將保存的純化菌株制備成種子培養液，按照10%接種量接入到發酵培養基中進行發酵培養，根據各菌株酶活性高低進行復篩，并將復篩得到的菌株進行保存。

菌株靜定:將篩選出的菌株用平板進行純培養，根據其菌落、菌絲、孢子形態及其生長特性，依據《真菌鑒定手冊》、《中國真菌志》、《菌物學概論》和《微生物學教程》等進行分類鑒定。

1.2.2 CMCase和FPAase酶活測定

CMCase 和 FPAase 酶活測定參考趙玉萍［7］高培基［8］和張瑞萍［9］所提供的方法。

1.2.3 菌株產纖維素酶的影響因素研究

(1)不同碳、氮源培養基對產酶的影響

實驗分別以稻草粉、麩皮、纖維素粉 (MCC)3種物質及其復合物為碳源替換基礎培養基中的CMCNa，不同碳源添加量均為20g/L，分別將不同碳源培養基裝入250mL錐形瓶中，按照5%接種比例接入菌種子液，在28℃下，160r/min震蕩培養120h，然后測定不同碳源的產酶量。

在基礎培養基中，分別添加2.5g/L的硫酸銨、氯化銨、碳酸按、硝酸銨、硝酸鉀、蛋白胨、牛肉膏、黃豆餅粉為氮源，其他物質元素不變，培養條件同上。培養后測定不同氮源的產酶量。

(2)溫度對產酶的影響

發酵液培養基成份和其他培養條件同1.2.3.1，分別在25、28、30、32、35、38℃下發酵培養120h，測定不同培養溫度的產酶量。

(3)初始pH對產酶的影響

發酵液培養基成份和其他培養條件同1.2.3.1，分別將培養基初始pH調至3、4、5、6、7、8，振蕩培養120h，測定不同初始pH的產酶量。

2.實驗結果與分析

2.1 篩選菌株的纖維素酶產量

將初篩得到的9株真菌，按照5%接種比例接入基礎培養基，依據1.2.3.1中的培養條件，震蕩發酵培養120h后，測定各菌發酵液產酶量，得到產酶量較高的菌株有4株，該4株菌的產酶活性測定結果如表1所示。從表表1可以看出，復篩得到的4株菌，其中CMCase活性較高的是TF3，達到241.3IU/mL，FPAase活性較高的是TF9，達到7.8IU/mL。

表1 菌株發酵液的纖維素酶(CMCase和FPAase)活力Tab.1 The CMCase and FPAase activities of strains in fermentation broth

2.2 目的菌種形態學分析和鑒定

通過富集培養和平板篩選，分別從伐木場鋸末堆土壤和森林公園腐朽樹木中，初步篩選出9株具有較大透明圈的真菌。分別是MF1、MF4、TF3、TF9，其中MF1、MF4源于腐朽樹木，TF3、TF9源于鋸末堆土。

在PDA平板上培養MF1、MF4、TF3、TF9，并觀察各菌落生長特征。其中MF1菌落初步形成白色絨毛狀，圓形，致密，隨著培養時間延長中部變為綠色，而后成為深綠色，隨生長期進一步延長，菌落出現輪狀濃密的菌絲并產生大量孢子。菌落背面現灰色。孢子梗分枝少，呈次級單分枝并有彎曲。分生孢子較大呈球狀。通過比對，與綠色木霉的生長特征最相似，初步鑒定為木霉屬，綠色木霉。MF4菌落初期呈現白色絮狀，而后變成灰綠色，菌落逐漸變厚，表面呈毛毯狀，外圈白色毛狀并向四周延伸。通過鏡檢，菌絲為白色有隔，分生孢子梗呈扇形輻射狀。初步鑒定為青霉屬。TF3菌落生長初期為白色絨毛狀，呈圓形，致密，而后菌落中部變成綠色，菌落出現輪狀有白色菌絲，最后菌落變成黃綠色，菌落背面現微黃色。孢子梗束狀，有三級分枝，分生孢子呈橢圓狀。初步鑒定為木霉屬，康氏木霉。TF9菌落生長初為白色，而后呈黑褐色厚絨毛狀，背面略呈黃色。分生孢子梗叢生，長短不同，分生孢子球狀，黑褐色。初步鑒定為黑曲霉。

2.3 菌株TF3的發酵產酶影響因素分析

為進一步考察所分離菌株的產酶能力，實驗以TF3為研究對象，對菌株的主要發酵條件進行了研究分析。

2.3.1 碳源、氮源對纖維素酶活性的影響

不同碳源對TF3產酶的影響實驗結果見表2，從實驗結果來看，不同碳源對產酶具有較明顯的影響。當發酵液加麩皮和纖維素處理后，菌株的產酶活性量最高，CMCase活性達到278.1 IU/mL，FPAase活性達到8.9 IU/mL。因此，TF3菌株發酵產纖維素酶的合適碳源為麩皮和纖維素粉的復合物。因為麩皮中含有豐富的微量元素，有利于菌體生長，同時纖維素粉對纖維素酶生產具有較強的誘導作用。當僅用稻草粉處理時，纖維素酶活性最低，其中CMCase活性只有117.2 IU/mL，CMCase活性僅為4.1 IU/mL。可見，麩皮纖維素粉復合物與稻草粉之間差異最為顯著。添加稻草粉的CMCase活性和CMCase活性平均值分別是160.1 IU/mL和5.5 IU/mL，添加麩皮的CMCase活性和CMCase活性平均值分別是215.8 IU/mL和7.4 IU/mL，添加纖維素粉的CMCase活性和CMCase活性平均值分別是236.6 IU/mL和6.8 IU/mL。從以上數據來看，發酵液中添加纖維素粉有利于CMCase量的提高，添加麩皮有利于FPAase量的提高。

表2 不同碳源對TF3產酶的影響Table 1 Effect of different carbon sources on the cellulase production of TF3

不同氮源對TF3產酶的影響實驗結果見表3，從實驗結果來看，不同氮源對產酶也具有較大影響。從產酶活性大小可以得出，硫酸銨提供氮源時，產酶活性最高，黃豆餅粉作為氮源時，其產酶活性最低，可見發酵產酶的最適氮源為硫酸銨，其次是氯化銨。總之，銨態氮產酶效果好于硝態氮，無機氮產酶效果好于有機氮。

表3 不同氮源對TF3產酶的影響Table 1 Effect of different nitrogen sources on celluase activity

2.3.2 溫度對產酶的影響

實驗研究測定了TF3在設定的梯度溫度下的產酶能力，實驗結果見圖1。從圖示可以看出，溫度對TF3產酶能力有明顯影響，當發酵溫度為32℃時，CMCase活性最高達到261.7 IU/mL;當發酵溫度為30℃時，FPAase活性最高，達到7.3 IU/mL。當發酵溫度過低或過高時，CMCase和FPAase活性都顯著降低，因為發酵液溫度過低時，不利于微生物的快速生長，蛋白質合成受到抑制，從而影響產酶量;相反，當發酵液溫度過高時，加快了酶蛋白的變性速度，從而使酶活性喪失。可見，TF3發酵產酶的適宜溫度在30～32℃范圍內。

圖1 發酵溫度對產纖維素酶的影響Fig.1 Effect of incubating temperature on the cellulase production

2.3.3 初始pH對產酶的影響

實驗研究測定了TF3在不同初始pH發酵產酶能力，實驗結果見圖2。從圖示可以看出，發酵液初始pH對產酶量具有明顯影響，當發酵液初始pH為6時，CMCase活性最高，達到248.3 IU/mL;當發酵液初始pH為7時，FPAase酶活達到最高值7.5 IU/mL。可見，TF3發酵產纖維素酶的最適初始pH范圍大致在6～7之間。

圖2 初始pH對產纖維素酶的影響Fig.1 Effect of initial pH on the cellulase production

3.結論

通過初篩和復篩，分別從伐木場鋸末堆下土壤和森林公園腐木中篩選得到了4株產纖維素酶活性較高的菌株，經初步鑒定，本別是綠色木霉－MF1、青霉屬－MF4、康氏木霉－TF3、黑曲霉－TF9，詳見表1。通過研究考察了碳源、氮源、溫度和初始pH對TF3產酶的影響，結果顯示，TF3發酵產纖維素酶的最佳碳源為麩皮纖維素復合物，最佳氮源為硫酸銨，最適發酵溫度范圍是30～32℃，發酵液最適初始pH范圍是6～7。

實驗僅從溫度和初始pH兩個方面研究了它們對TF3產酶的影響，要進一步該株菌的產酶潛力大小，還需要對更多的因素及其各因素之間的相互作用進行研究。本實驗成功篩選出了4株菌，為后續的應用研究奠定了良好的基礎。

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Isolation and identification of cellulase－producing fungus and the effects on the cellulase production

LI Yi－ran;MA Kang
(Department of Life Science，Shangqiu Normal University，Shangqiu 476000，China)

Four cellulase－ producing fungus were screened from soil and rotten wood sample．They were identified as T．viride persex－MF4，Penillium －MF4，Trichoderma koningii－TF3，Aspergillus niger－TF9．The influence factors on the cellulase－producing by the TF3 were studied．The results indicated that the optimum conditions of producing cellulase were as follows:carbon source was bran and micro－cellulose complex，nitrogen source was ammonium sulfate，culture temperature was 30－32℃，initial pH was 6—7．

Screen;identification;cellulase;influence factors

Q939.9

A

1671－7406(2011)09－0075－06

2011－05－11

李毅然 (1980—)，男，河南商丘人，商丘師范學院，碩士，助教。研究方向:環境微生物。

(責任編輯 徐成東)