生長抑素對胃癌VEGFs和VEGF受體影響的實驗研究

趙 濱 楊 靜 孫勇偉 蔡 端

胃癌是人類常見的惡性腫瘤，每年全世界都有80萬人因此死亡，一般而言，胃癌患者平均5年存活率大約22%，而晚期胃癌患者5年存活率低于5%。研究表明，血管和淋巴管的惡性增生是腫瘤轉移和惡化的重要原因［1］。內皮細胞特異性生長因子及其受體是血管淋巴管增生的重要原因之一［2～5］。

研究表明，VEGF過表達與胃癌患者不良預后密切相關，抑制VEGF表達能夠減弱胃癌的成瘤性［6～9］。表明 VEGF過表達會引起腫瘤的惡化，并且能將VEGF作為腫瘤治療的重要靶點。

生長抑素是1種重要的內生性抑制因子，最初由豬的下丘腦中獲得［10］。生長抑素的激動劑如奧曲肽(octreotide)被廣泛用于肢端肥大患者，胰島瘤和許多良性腫瘤的激素調控［11～13］。研究表明生長抑素很有可能通過抑制VEGF而發揮抑制血管生成的作用，因此可能在內分泌瘤中發揮著重要的作用［14］。有研究表明，生長抑素及其類似物在體內和體外發揮作用依賴于血管的發育程度［15］。我們推斷，生長抑素在胃癌血管生成中發揮著作用，并能影響VEGF水平。為此，我們通過建立隨機實驗，以探討生長抑素對胃癌患者VEGF水平的影響。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選擇本院普通外科收治的行根治性手術胃癌患者60例，均經病理檢查證實，病理分期Ⅲ～Ⅳ期，并有可測客觀病灶。隨機分組，兩組性別比例和平均年齡等見表1。兩組患者術前肝、腎功能均正常，無糖尿病、甲狀腺功能亢進等代謝性疾病，無任何免疫性疾病，以往6個月內未接受過糖皮質激素和其他免疫抑制劑，未接受過放療或化療，愿意接受全腸內營養，在性別、年齡、病變部位及術式等方面兩組差異無統計學意義(P ＞0.05)，見表 1。

表1 2組患者基本資料的比較(例，%)

1.2 治療方法

實驗組患者術前靜脈注射生長抑素3 mg，3次/天，連續3天。對患者行常規檢查，記錄患者相關的各項體征、體重、全血計數和血清學指標，藥物引起的不良反應均記錄在案。

1.3 標本收集

手術切除的新鮮胃癌標本用10%的福爾馬林液固定，常規石蠟包埋或直接溶于Trizol備用。

1.4 免疫組化

常規石蠟包埋的組織，切成4 μm切片，依次經二甲苯脫蠟、100%、95%、80%、70%梯度酒精復水?？乖迯筒捎貌Ｆ霗幟仕峋彌_液加熱至99℃，保持30 min再室溫自然冷卻。3%過氧化氫浸泡5 min以去除內源性過氧化物酶活性。一抗KDR/Flt-1(購自Santa Cruze)，均以1∶100配成工作濃度，4℃孵育過夜。磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline，PBS)洗滌2次后用生物素標記的二抗(上海長島)室溫孵育30 min，再用鏈酶素辣根過氧化物酶孵育30 min，DAB(上海長島)試劑盒顯色。蘇木精復染后封片。PBS代替一抗作為陰性對照，根據抗體說明書以大腸癌標本作為陽性對照。

每張切片選取5個200倍視野，用Olympus BX51顯微鏡拍攝(日本)。圖像分析采用 Image-Pro Plus 6.0軟件計算每張圖片中陽性表達部分的平均光密度(mean optical density，mean OD)及累積光密度(integral OD，IOD)。

1.5 實時定量PCR

胃癌組織50～100 mg溶于1 ml TRIzol中，根據試劑說明書提取總 RNA，并測定濃度。取總 RNA 1 mg，補充無核酸酶水至9.9 ml，70 ℃孵育10 min后，短暫離心后，置于冰上;在同管中依次加入:MgCl2(25 mmol/L)4 μl、10 × 逆轉錄緩沖液 2 μl、dNTP 混合液(10 mmol/L)2 μl、RNA 酶抑制劑(40 U/μl)0.5 μl、Oligo(dT)15 引物(0.5 μg/μl)1 μl、AMV 逆轉錄酶(5 U/μl)0.6 μl。42 ℃下孵育 15 min，然后 95 ℃作用5 min終止反應，4℃下孵育5 min，逆轉錄產物cDNA保存于-20℃備用。使用iCycler IQ(Bio-Rad，美國)進行 Realtime PCR分析。以 β-actin作為內參。VEGF-A的引物序列為5’-CCA TGA ACT TTC TGC TGT CTT-3’(sense)和 5’-TCG ATC GTT CTG TAT CAG TCT-3’(antisense)，β-actin 引物序列為 5’-GTG CGT GAC ATT AAG GAG-3’(sense)和5’-CTA AGT CAT AGT CCG CCT-3’(antisense)。

1.6 酶聯免疫反應實驗

實驗組分別在給藥前和術后24、48、72 h時行抽血取樣。通過離心獲得血清后行酶聯免疫分析血清VEGF水平。

1.7 統計學處理

2 結果

2.1 生長抑素抑制VEGF表達水平

生長抑素預處理前兩組血清VEGF水平無明顯差異，而術前及術后生長抑素預處理組VEGF水平均明顯低于對照組(圖1)。

2.2 生長抑素對VEGF各亞型mRNA水平的影響

實時定量PCR檢測結果顯示，VEGF各亞型A、B、C的RNA水平，生長抑素預處理組與對照組比較并無明顯差異(圖2)。

2.3 生長抑素對VEGFR2和VEGFR1水平的影響

免疫組化結果顯示，VEGF受體表達位于胃癌原發灶及臨近黏膜組織中。生長抑素預處理并未明顯改變VEGFR1和R2表達水平，而VEGFR3水平明顯下降，同樣VEGFR3不僅表達于原發灶，而且表達于黏膜組織。VEGFR3主要表達于內皮細胞中及黏膜下。VEGFR3陽性表達血管主要位于正常胃黏膜的下半部及臨近肌肉部位的黏膜下層(圖3)。

圖1 兩組血清VEGF水平比較

圖2 生長抑素預處理對VEGF各組mRNA水平的影響

圖3 2組中VEGFR1、R2、R3表達的平均光密度圖

3 討論

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一。在全世界范圍僅次于肺癌而居各種惡性腫瘤死因的第二位。胃癌患者生存率的提高有賴于胃癌的早期診斷、早期治療、對轉移和復發的有效預防及尋找新的治療靶點提高胃癌的治療水平。血管生成對于腫瘤的轉移起著至關重要的作用。腫瘤細胞能夠產生和釋放許多促血管和抗血管的因子來調節血管的生成。VEGFs是最常見的血管生長因子家族，其能夠通過與受體的結合促進血管的生成，從而影響腫瘤的進程。在胃癌患者中，VEGF過表達與不良預后緊密相連，提示我們抗VEGF治療對胃癌的治療可能存在作用［16，17］。生長抑素及其類似物能夠抑制VEGF的產生，從而影響血管的生長，起到治療腫瘤的作用［18］。同樣也有研究報道生長抑素及其類似物可能是通過影響VEGF的水平來影響血管生成的［18］。在本實驗中，我們發現生長抑素的預處理可以降低血清VEGF的水平，并且下調VEGF受體的表達。

除了影響血管生成以外，VEGF同樣可以作為1個調控血管生成的標志［19，20］。我們研究結果顯示，可溶性VEGF血清水平的下降，可能影響到后來的血管生成。但同時VEGF各亞型的mRNA水平并沒有改變。我們推斷生長抑素可能是通過影響VEGF蛋白的合成和降解來發揮作用。也有研究報道，在肝癌患者中使AZD2171引起時間和劑量依賴的VEGFR2的減少，VEGF水平反而升高［22～24］。說明在不同腫瘤的發展過程中，促血管生長因子起著兩面的作用［21］。

另外，我們的研究結果顯示，在生長抑素預處理的患者中VEGF受體3的表達水平明顯下降，而其配體VEGF-C并沒有改變。VEGF-C與VEGF受體3的表達有利于淋巴管的生成，而淋巴管對于腫瘤基質有重要影響。VEGF-C與VEGF受體3的活化，腫瘤細胞更易于發生轉移。有研究報道，VEGF-C與VEGF受體3存在著重要的關聯，腫瘤基質中VEGF受體3陽性細胞數量與胃癌惡性侵襲程度相關［25］。

綜上所述，在進行胃癌切除術的患者中，預先使用生長抑素，可降低血清VEGF水平，同時可影響VEGF受體3的表達。生長抑素可以通過調控VEGF及其受體水平，從而影響血管和淋巴管的生成，而作為胃癌切除術患者治療的1種重要佐劑。

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