乙型肝炎病毒前S2區(qū)缺失突變與肝癌相關(guān)性研究

強(qiáng)福林 吳徐明 楊自力 崔曉燕 李海波

原發(fā)性肝癌是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，近年來(lái)的資料特別發(fā)現(xiàn)，至少有80%的肝細(xì)胞肝癌患者有乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染［1，2］。前S1、前S2基因合并稱為前S基因，兩者編碼的蛋白在病毒與細(xì)胞特異性結(jié)合方面起著重要作用。前S區(qū)是HBV 基因組中變異發(fā)生較多的部位［3，4］，研究表明，在HBsAg陽(yáng)性人群中，有18.3%的人存在前S基因的突變，而中國(guó)人突變的比例則高達(dá)22.4%。

南通地區(qū)是我國(guó)乙型肝炎的高發(fā)區(qū)，同時(shí)也是我國(guó)肝癌的高發(fā)地區(qū)，多年來(lái)一直是我國(guó)乙型肝炎及肝癌重要的研究現(xiàn)場(chǎng)［5］。我們現(xiàn)就南通地區(qū)肝癌患者血清HBV PreS2區(qū)的缺失突變情況作一研究，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

HBV無(wú)癥狀攜帶者(asymptomatic HBV carriers，ASC)，均為到南通市疾病預(yù)防控制中心進(jìn)行健康體檢者，年齡21～39歲，均未接種過(guò)乙型肝炎疫苗，也未使用過(guò)任何抗HBV藥物，體檢結(jié)果顯示肝功能均正常。肝癌(hepatocarcinoma，HCC)患者均為南通市腫瘤醫(yī)院住院治療的肝癌患者，年齡42～67歲。上述HBV無(wú)癥狀攜帶著和肝癌患者均符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)傳染病與寄生蟲(chóng)學(xué)分會(huì)、肝病學(xué)分會(huì)聯(lián)合修訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)［6］，血清樣品均保存于－70℃低溫冰箱。

1.2 主要試劑及引物

肝炎病毒診斷試劑(HBsAg、抗-HAV-IgM、抗-HDV、抗HCV)均購(gòu)自上海科華生物工程股份有限公司，HBV-DNA熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自深圳匹基生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司，谷丙轉(zhuǎn)氨酶 (ALT)試劑盒為Wako公司產(chǎn)品。PreS擴(kuò)增引物根據(jù) PUBMED中HBV序列設(shè)計(jì)，由上海之江生物技術(shù)公司合成。上游引物 P1:5’-TCA CCA TAT TCT TGG GAA CA-3’(2817～2836 nt)，下游引物 P2:5’-GAG AGA AGT CCA CCA CGA GT-3’(252～271 nt)，目的基因長(zhǎng)度為670 bp。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

乙型肝炎病毒抗原、抗體，甲型肝炎IgM抗體，丙型肝炎抗體，丁型肝炎抗體，血清ALT，HBV-DNA，均嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書(shū)操作。

HBV PreS基因的擴(kuò)增:采用酚-氯仿法抽提血清DNA，PCR 條件為預(yù)變性 94℃ 25 min，94℃ 20 sec，50℃ 30 sec，72℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)，最后一個(gè)循環(huán)72℃10 min。PCR產(chǎn)物純化后送上海之江生物技術(shù)公司測(cè)序，引物為P1。將所測(cè)基因序列與HBV不同型PreS序列用DNAMAN軟件比對(duì)。

2 結(jié)果

2.1 HBV無(wú)癥狀攜帶者和肝癌患者HBV preS2缺失突變情況

在實(shí)驗(yàn)中，首先篩選出甲肝IgM抗體、丙型肝炎抗體和丁型肝炎抗體檢測(cè)均為陰性的研究對(duì)象，以排除其他肝炎感染對(duì)本研究結(jié)果的影響。與HBV無(wú)癥狀攜帶組相比較，肝癌組ALT水平顯著增高，而兩組HBV-DNA濃度并無(wú)顯著差異。在肝癌組中，23.08%的患者存在PreS2區(qū)的缺失突變，與無(wú)癥狀攜帶者比較有顯著差異(表1)。

表1 HBV無(wú)癥狀攜帶者和肝癌患者HBV PreS2缺失突變情況

2.2 肝癌患者HBV preS2缺失突變分析

與HBV野毒株相比較，本研究的26例肝癌患者中，有6位存在著HBV preS2區(qū)的缺失突變，缺失長(zhǎng)度分別為30～45 bp，對(duì)應(yīng)缺失10～15個(gè)氨基酸。缺失的位點(diǎn)在aa 126～141區(qū)域(表2)。

表2 肝癌患者HBV preS2缺失突變病例

3 討論

肝癌的發(fā)病機(jī)理十分復(fù)雜，HBV感染及HBV基因組的多態(tài)性可能顯著影響病毒與宿主的相互關(guān)系及患者的臨床過(guò)程，HBV基因組的變異可能與肝癌的發(fā)生、發(fā)展存在某種聯(lián)系。

前S基因與HBV病毒的一些重要生理功能有關(guān)，其變異將影響疾病的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程。前S基因變異，特別是前S2基因起始密碼的變異，可能是導(dǎo)致肝炎重癥化的原因之一。多個(gè)研究小組報(bào)道了前S基因的缺失突變，最長(zhǎng)的缺失突變可達(dá)264 bp，最短的為9 bp，研究表明，這大多是由真核細(xì)胞mRNA剪接機(jī)制，以及HBV DNA聚合酶所具有的逆轉(zhuǎn)錄酶活性參與DNA模板轉(zhuǎn)換機(jī)制等造成的部分基因缺失突變［7，8］。

已有研究結(jié)果表明肝癌的發(fā)展與HBV preS2及其突變相關(guān)。HBV preS2可抑制p53而導(dǎo)致肝癌的發(fā)生;HBV preS2突變通過(guò)p27(Kip1)的降解而導(dǎo)致了DNA損傷;HBV preS2突變可通過(guò)Cdk2途徑而導(dǎo)致視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤抑癌基因過(guò)磷酸化［9，10］。

本研究發(fā)現(xiàn)，在肝癌患者HBV preS2中存在大量的缺失突變，而Genbank收錄的無(wú)癥狀攜帶者的preS2基因，以及本研究測(cè)定的無(wú)癥狀攜帶者的pre-S2基因并無(wú)大量缺失突變發(fā)生，提示肝癌患者HBV前S基因?yàn)楦叨茸儺悈^(qū)，而preS2區(qū)的缺失突變則可能與肝癌的發(fā)生密切相關(guān)。

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