宮頸癌組織中CD146和MMP-14表達的意義及相關性分析

朱 燕 楊其昌 劉宏斌 劉曼華 張曉娟 沈 屹

黏附分子CD146(Mel-CAM)是新近發(fā)現(xiàn)的新生血管標志物，介導細胞與細胞之間、細胞與細胞外基質(zhì)之間的黏附，其過度表達能促進腫瘤血管生成及遠處轉(zhuǎn)移;基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)能降解細胞外基質(zhì)(extra cellularmatrix，ECM)及基膜(basementmembrane，BM)成分，是促進腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移的1種重要的酶類，其中主要成員有MMP-14等。本文通過檢測CD146、MMP-14在宮頸鱗癌中聯(lián)合表達情況，旨在探討它們在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展及血管生成中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

收集我院1998年～2008年手術(shù)切除的82例宮頸鱗癌標本作為實驗組，該組患者術(shù)前均未給予化療和放療，年齡32～81歲，中位年齡53歲。按照Broders分類標準分類［1］:鱗癌Ⅰ級 24 例(29.27%);Ⅱ級33 例(40.24%);Ⅲ級 25 例(30.49%)。按照 FIGO臨床分期標準進行分期［2］:Ⅰ期 +Ⅱ期 61例(74.39%)，Ⅲ期 +Ⅳ期 21 例(25.61%)。按照淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況分組:無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移62例(75.61%);有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移20 例(24.39%)。參照文獻方法［3］，82 例宮頸癌按間質(zhì)浸潤情況分組:侵及或未侵及淺肌層25例(30.49%);侵至深肌層 57例(69.51%)。收集同期慢性宮頸炎24例及CIN 48例(CINⅡ級27例，Ⅲ級21例)作為對照組。所有標本均經(jīng)病理檢查確診。

1.2 方法

所有標本均經(jīng)10%中性福爾馬林液固定，常規(guī)處理，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，進行HE染色及免疫組織化學SP法染色，鼠抗人單克隆抗體CD146(工作濃度1∶30)、MMP-14(工作濃度1∶60)均購自北京中杉金橋生物有限公司。用 PBS液取材一抗作為陰性對照，用試劑公司提供的陽性切片作為陽性對照。

1.3 免疫組化結(jié)果判斷標準

CD146陽性表達呈棕黃色細顆粒，主要定位于癌及癌旁組織的血管內(nèi)皮，部分表達于癌細胞。CD146標記的微血管數(shù)量用MVD值表示。MVD測定參照Weidner［4］方法，首先在低倍鏡( ×40)下觀察全部視野，在每張切片上選擇3個富含血管組織的“熱點”區(qū)，即棕黃染色密度最高的區(qū)域，然后，在高倍鏡(×100)下計數(shù)熱區(qū)CD146表達的血管數(shù)目，凡單個或聚集在一起的數(shù)個被染為棕黃色或棕褐色的內(nèi)皮細胞，只要與鄰近血管、腫瘤細胞和其他結(jié)締組織成分清楚分開的即為1個能夠計數(shù)的微血管。肌層太厚及血管腔面積大于8個紅細胞直徑的血管均不計數(shù)。取3個視野的微血管數(shù)，由計算機自動標記及分析，并求和取平均值作為該例MVD。

MMP-14免疫組化陽性染色為棕黃色顆粒，位于腫瘤細胞胞質(zhì)。陽性反應的分級參照文獻［5］采用兼顧陽性細胞染色強度和陽性細胞所占百分比的判斷標準:每張切片隨機選取5個高倍視野，首先按陽性細胞所占百分比評分:陰性為0分，陽性細胞數(shù)≤10%為1分，11% ～50%為2分，51% ～75%為3分，＞75%為4分;再按染色強度評分:無色為0，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分;最后按兩者乘積分數(shù)分為4個等級:－(0、1、2分)，+(3、4 分)，++(6、8 分)，+++(9、12 分)。

1.4 統(tǒng)計分析

采用美國計算機研究中心研制的Stata 7.0統(tǒng)計軟件包進行。MVD值以s表示。不同組間的MVD比較采用t檢驗、F檢驗，率的比較采用χ2檢驗。相關性分析用列聯(lián)相關系數(shù)。檢驗水準α =0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組織中CD146蛋白表達的情況

CD146表達主要定位于癌組織及癌旁組織的血管內(nèi)皮細胞膜上，部分表達于癌細胞。CD146在CIN中呈不同程度的表達，在正常宮頸上皮中表達較弱。不同宮頸病變組織中CD146標記的MVD結(jié)果見表1。

表1 不同宮頸病變組織中CD146標記的MVD比較(s)

表1 不同宮頸病變組織中CD146標記的MVD比較(s)

注:F*為單因素方差分析

組別 例數(shù) CD146標記的MVD F*P 82 33.76 ±7.32 96.37 0.000宮頸上皮內(nèi)瘤變 48 24.49 ±4.21慢性宮頸炎宮頸鱗癌24 5.81 ±2.43

由表1可見，3組CD146標記的MVD存在顯著差異，進一步分析顯示，宮頸鱗癌組織 CD146標記的MVD顯著高于CIN及慢性宮頸炎組織(P＜0.01)。

2.2 CD146標記的MVD與宮頸鱗癌臨床病理因素的關系(表2)

表2 CD146標記的MVD與宮頸鱗癌臨床病理因素的關系(s)

t P年齡(歲)臨床病理因素 例數(shù) CD146標記的MVD≤53 39 32.47 ±6.52＞53 43 34.91 ±7.92 －1.51 0.13浸潤深度≤淺肌層 25 25.76 ±6.32＞深肌層 57 38.59±4.48 －10.48 0.00組織學分級Ⅰ級 24 24.82 ±5.29Ⅱ級 33 32.38 ±7.27Ⅲ級 25 39.75 ±5.62 13.38 0.00淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無62 28.27 ±5.46有20 39.72 ±3.19 －8.87 0.00 FIGO分期Ⅰ +Ⅱ期 61 28.59 ±5.91Ⅲ+Ⅳ期21 41.52 ±6.72 －8.34 0.00

由表2可見，CD146標記的MVD與腫瘤浸潤深度、組織學分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及FIGO分期顯著相關(P＜0.01)，CD146標記的 MVD與患者年齡無關(P＞0.05)。

2.3 各組織中MMP-14蛋白的表達情況

MMP-14蛋白主要定位于細胞質(zhì)中，呈棕黃色。宮頸鱗癌組中72例(87.80%)呈陽性表達，CIN組中27例(56.25%)呈陽性表達，慢性宮頸炎組中2例呈弱陽性表達(8.33%)，3組陽性率比較差異顯著(P＜0.01)。組間分析結(jié)果顯示，MMP-14陽性率宮頸鱗癌組與CIN及慢性宮頸炎組比較均有顯著性差異(P＜0.01)。

統(tǒng)計結(jié)果顯示，MMP-14表達與宮頸鱗癌浸潤深度、組織學分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和FIGO分期呈正相關，與患者年齡無相關性(表3)。

2.4 CD146與MMP-14蛋白表達的相關性

按照宮頸鱗癌中CD146標記的MVD均值30為界，分為LCD146(MVD≤30)(48例)和HCD146(MVD＞30)(34例)。用列聯(lián)相關系數(shù)分析其與MMP-14表達的相關性(表4)。

表3 MMP-14表達與宮頸鱗癌臨床病理因素的關系(例)

表4 宮頸鱗癌中CD146標記的MVD與MMP-14蛋白表達的相關性(例，%)

由表4可見，宮頸鱗癌組織中 CD146標記的MVD，與MMP-14蛋白表達呈正相關性(P＜0.01)，列聯(lián)系數(shù) Cramer＇s V 和 Goodman-Kruskal的 gamma均 ＞0。

3 討論

CD146是1種Ca2+非依賴性細胞黏附分子的跨膜蛋白，屬于免疫球蛋白超家族(Igsf)成員，介導細胞與細胞之間、細胞與細胞外基質(zhì)之間的相互作用，有助于局部黏連聚集、細胞骨架重組、細胞間相互作用、細胞形態(tài)的維持及細胞游走和增殖的調(diào)控［6］。近來研究發(fā)現(xiàn)CD146在許多惡性腫瘤組織中高表達，提示其與腫瘤發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移有關，可作為判斷腫瘤預后的參考指標［7，8］。MMPs是一組 Zn2+依賴性的蛋白水解酶，能夠降解多種基膜和細胞外基質(zhì)成分，在腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移過程中起重要作用。MMPs包含許多成員，其中MMP-14能活化細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)蛋白的活性且能激活其它的MMPs，既可以直接和(或)間接降解ECM和BM，也可以誘導腫瘤血管生成，維持腫瘤的不斷生長，并為腫瘤細胞進入循環(huán)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移提供條件。

我們的研究結(jié)果顯示:CD146在宮頸鱗癌中表達主要定位于癌及癌旁組織的血管內(nèi)皮細胞，在宮頸上皮內(nèi)瘤變中見不同程度的表達，而在慢性宮頸炎上皮中表達較少。宮頸鱗癌組織中CD146標記的MVD顯著高于其它各組。本研究結(jié)果顯示，以CD146標記的宮頸鱗癌組MVD與患者年齡無關，但淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性組CD146標記的MVD顯著高于淋巴結(jié)陰性組。說明宮頸鱗癌淋巴道轉(zhuǎn)移中伴有大量血管形成。其原因是腫瘤中大量新生血管形成，增加了腫瘤細胞的營養(yǎng)，使腫瘤細胞呈指數(shù)生長，并向周圍浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，同時CD146通過調(diào)節(jié)細胞間的黏附聚集、增殖參與腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移過程。我們的結(jié)果提示CD146蛋白參與、促進宮頸上皮從癌前病變、原位癌到浸潤癌的發(fā)生發(fā)展過程，其表達情況可作為判斷宮頸癌發(fā)展進程的參考指標。這與馬建華等［9］在前列腺中的研究結(jié)果及張龍云等［10］在卵巢癌中的研究結(jié)果基本一致。文獻報道CD146在前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、食管癌等惡性腫瘤中呈高水平表達，且表達水平與這些惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移復發(fā)、血管生成及預后相關［9～12］，但也有文獻報道［13］乳腺癌中CD146表達呈下調(diào)，與我們的結(jié)果及上述文獻中CD146呈過表達相反，范嫏娣等認為這反映了腫瘤生物學的總體復雜性。

我們研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MMP-14在宮頸鱗癌患者中的表達明顯增強，說明宮頸鱗癌的侵襲性增強與MMP-14高表達有關，MMP-14在不同臨床分期和不同組織學分級的宮頸鱗癌組織中，Ⅲ+Ⅳ期MMP-14表達強度顯著高于Ⅰ+Ⅱ期;Ⅲ級MMP-14表達顯著高于Ⅰ、Ⅱ級。提示MMP-14是宮頸鱗癌發(fā)生中1種重要的蛋白水解酶，能夠降解多種基膜和細胞外基質(zhì)成分，使宮頸鱗癌細胞易于穿透血管壁，由血循環(huán)進入淋巴循環(huán)，形成淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移。Yamashita等［14］證實MMP-14在食管癌的進展期起關鍵作用。本組結(jié)果與他們研究結(jié)論一致，提示MMP-14可以作為反映宮頸癌侵襲轉(zhuǎn)移能力的生物學標志物。

我們研究結(jié)果還顯示，CD146表達與MMP-14表達密切相關。腫瘤轉(zhuǎn)移過程需要腫瘤細胞進出血管系統(tǒng)，CD146陽性的腫瘤組織中的血管內(nèi)皮細胞，通過與腫瘤細胞上的CD146配體結(jié)合，參與腫瘤細胞進出血管系統(tǒng)。所以，血管內(nèi)皮細胞中表達的 CD146，為CD146配體陽性的腫瘤細胞進出血管提供了途徑。腫瘤細胞中CD146-CD146配體間的相互作用則引起了腫瘤細胞的聚集，這些細胞團引起血管堵塞，繼而黏附于血管內(nèi)皮，CD146陽性的內(nèi)皮細胞介導腫瘤細胞侵入周圍組織。另外，CD146介導形成的腫瘤細胞團塊促進了腫瘤細胞間的相互作用，分泌生長因子，也促進了腫瘤的生長。CD146參與腫瘤細胞的黏附、轉(zhuǎn)移及新病灶的形成。而MMP蛋白能降解細胞外基質(zhì)及基膜成分，亦能誘導腫瘤血管生成，目前研究表明MMP-14在多種腫瘤組織中呈過度表達，上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子促進腫瘤的生長和血管生成，協(xié)同參與多種腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過程。由此可知兩者在腫瘤發(fā)展中確實存在著一定的相關性?？傊?，宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展是多基因損傷、多級因子相互作用的復雜過程。

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