轉基因植物乳桿菌LP590體外耐受性質的研究

劉海燕，郭 星，許文濤，3，王洪新，田洪濤，黃昆侖，3，*

（1.江南大學食品學院，食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇無錫214122；2.中國農業大學食品科學與營養工程學院，食品安全實驗室，北京100083；3.農業部轉基因生物食用安全檢驗監督測試中心，北京100083；4.河北農業大學食品科技學院，河北保定071001）

轉基因植物乳桿菌LP590體外耐受性質的研究

劉海燕1，2，郭 星2，許文濤2，3，王洪新1，田洪濤4，黃昆侖2，3，*

（1.江南大學食品學院，食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇無錫214122；2.中國農業大學食品科學與營養工程學院，食品安全實驗室，北京100083；3.農業部轉基因生物食用安全檢驗監督測試中心，北京100083；4.河北農業大學食品科技學院，河北保定071001）

植物乳桿菌是乳酸菌中的一種，它具有許多適應于工業生產的優良性質。轉基因乳桿菌LP590是由植物乳桿菌LP為親本，插入nisin基因得到的。為了研究轉基因植物乳桿菌LP590的體外耐受性質，本實驗以LP590作為對照，將LP590對高溫（52℃）、低溫（4℃）、乙醇（20%）、過氧化氫（2%）、氯化鈉（4mol/L）的耐受性進行了研究。研究表明，LP590與LP在4℃和20%乙醇環境中暴露240min，兩株菌有相同的耐受性。而LP590比LP更加耐受高溫（52℃）、過氧化氫（2%）和氯化鈉（4mol/L）。從研究結果可以看出，轉基因植物乳桿菌LP590的體外耐受性總體優于LP，這也為從整體上評價轉基因微生物提供了依據。

乳酸菌，轉基因乳酸菌，體外耐受

乳酸菌是一類應用廣泛的微生物，尤其在食品工業中，它添加到食品中產生風味物質，作為發酵劑，在釀酒和乳品生產中更是應用廣泛。乳酸菌之所以被廣泛應用，是因為它無毒安全，并且具有許多適于工業生產的優良性質，如耐熱、耐冷、耐鹽、耐受乙醇等［1］。隨著轉基因技術的發展，為了滿足人們的需要出現了轉基因的微生物。正是因為乳酸菌的許多優點使它成為食品級的表達載體，使乳酸菌在工業生產中發揮更大的作用［2］。植物乳桿菌（LP）菌株分離于保健品中，以LP菌株為親本，將抗生物防腐劑的nisin基因插入其中，成為了轉基因乳桿菌LP590，目的是使轉基因乳桿菌LP590在有生物防腐劑存在時繼續發揮益生菌的作用［3-4］。而在轉入外源基因后，該菌株LP590的體外耐受性如果受到影響，它的用途會受到極大限制，所以有必要對轉基因植物乳桿菌LP590的耐受性進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

植物乳桿菌LP（AS1.2986）、轉基因植物乳桿菌LP590（LM0230） 以上兩種菌株均由河北農業大學田洪濤老師惠贈；MRS液體復合培養基和MRS瓊脂復合培養基 北京陸橋技術公司。

恒溫水浴鍋 北京市長風儀器儀表公司；UVIKON XL-172紫外-可見分光光度計 法國SECOMAM公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌懸液制備 兩株菌分別接種在MRS液體培養基中，厭氧培養16h。取培養好的菌液10mL用離心機低速離心，并用無菌生理鹽水洗菌2次。將菌體重懸于10mL的生理鹽水中制成菌懸液。

分別用無菌生理鹽水配制20%的乙醇、15mmol/L的過氧化氫、4mol/L的氯化鈉，備用。

1.2.2 菌數的測定 將培養到一定時間的菌液用生理鹽水稀釋到適當的濃度梯度，然后用MRS瓊脂復合培養基涂板培養，24h后計數確定菌數。

1.2.3 溫度的耐受性 將裝有10mL無菌生理鹽水的試管分別放于52℃的水浴鍋和4℃的冰水混合物中，取0.1mL菌懸液分別加入其中混勻，保溫0、60、120、180、240min。

1.2.4 乙醇、過氧化氫、氯化鈉的耐受性 將裝有10mL 20%乙醇、15mmol/L的過氧化氫、4mol/L氯化鈉的試管放于37℃水浴中，各試管中分別加入0.1mL菌懸液混勻，保溫0、60、120、180、240min。在以上各個時間點取0.1mL培養液進行梯度稀釋，然后用MRS固體培養基平板厭氧培養16h計數。

1.3 統計方法

以上實驗均進行3個平行，所得數據用均數±標準差的形式給出，用T檢驗檢測兩組間差異的顯著水平，P＜0.05差異有顯著性。

2 結果與討論

2.1 LP和LP590菌株的耐熱性

結果見圖1。從圖中可以看出，LP590比LP菌株有較高的耐熱性，暴露240min后LP590菌株還有20%的活菌，而此時LP菌株幾乎沒有菌存活。

2.2 LP和LP590對低溫耐受性

結果見圖2。從圖中可以看出，2株菌對低溫的耐受性相似，都可以較好地耐受4℃低溫。

2.3 LP和LP590對20%乙醇耐受性

結果見圖3。從圖中可以看出，2株菌在暴露于20%乙醇240min后，都有近50%的菌存活，2株菌耐受乙醇的性質相似。

圖1 LP和LP590的耐熱性

圖2 LP和LP590的對低溫的耐受性

圖3 LP和LP590對20%乙醇的耐受性

2.4 LP和LP590對2%過氧化氫的耐受性

結果見圖4。從圖中可以看出，與LP菌株相比，LP590菌株對2%的過氧化氫有較好的耐受性，暴露240min后，LP590菌株還有55%以上的菌存活。

圖4 LP和LP590對20%過氧化氫的耐受性

2.5 LP和LP590對4mol/L氯化鈉的耐受性

結果見圖5。從圖中可以看出，LP590和LP菌株對4mol/L氯化鈉都有較好的耐受性，而LP590的耐受性更好，暴露240min后，活菌數達95%以上。

圖5 LP和LP590對氯化鈉的耐受性

3 結論

乳酸菌的體外耐受性是衡量它是否適合工業生產的重要指標之一［5］，因為在工業生產中往往會遇到極端的環境條件。比如在釀酒過程會有較高濃度的乙醇環境，在腌制醬菜時鹽濃度較高，而制備干粉的噴霧干燥過程中會有較高的溫度［3，6-8］。只有能夠耐受這些環境條件的乳酸菌才是理想的乳酸菌。從研究結果可以看出，LP590菌株的體外耐受性較好而且總體優于其親本LP菌株，從耐受性的角度來說轉基因菌株LP590具備經受工業生產中極端環境的要求，這一結果也為從整體上研究轉基因微生物提供了依據。

［1］Axel H，Sandrine B，Xavier G，et al.Starvation-induced stress resistance in Lactoccus lactis subsp.lactis IL1403［J］.Applied Environmental Microbiology，1994，9：3474-478.

［2］Chou L，Weimer B.Isolation and characterization of acid-and bile-tolerant isolates from strains of Lactobacillus acidophilus［J］.Dairy Science，1999，82：23-31.

［3］WangYY.Study of lacticacid bacteria and expression system［D］.College of Food Science and Technology，Fudan University，2002.

［4］De Vuyst，L Leroy，F.Bacteriocins from lactic acid bacteria：production，purification，and food applications［J］.Microbiology Biotechnology，2007，13：194-199.

［5］Gastro Net Australia，Your digestive system，downloaded from http：//www.gastro.net.au/frame_digestive.htmL on 14.06.2001.

［6］Jenkins D E，Schultz J E，Matin，A.Starvation induced crossprotection against heat or H2O2challenge in Escherichia coli［J］.Bacteriology，1988，170：3910-3914.

［7］Klaenhammer TR.Probiotic bacteria：today and tomorrow［J］. Nutrition，2000，130：415-416.

［8］Mierau I，Kleerebezem M.10 years of the nisin-controlled gene expression system（NICE）in Lactococcus lactis［J］.Applied Microbiology Biotechnology，2005，68：705-717.

Study on tolerance to multistresses in vitro for genetically modified Lactobacillus 590

LIU Hai-yan1，2，GUO Xing2，XU Wen-tao2，3，WANG Hong-xin1，TIAN Hong-tao4，HUANG Kun-lun2，3，*
（1.State Key Laboratory of Food Science and Technology，College of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.Laboratory of Food Safety，College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China；3.The Supervision，Inspectionamp;Testing Center of Genetically Modified Food Safety，Ministry of Agriculture，Beijing 100083，China；4.Institute of Food Science and Technology，Hebei Agricultural University，Baoding 071001，China）

Lactobacillus as lactic acid bacteria has many excellent traits，which meets the needs of industrial production.Genetically modified（GM）LP590 was obtained from LP by inserting into the gene nisin，which can resist nisin and play a role in bio-preservative.To overall assess the safety of GM LP590 and establish an evaluation model in vitro，some useful explorations were carried out.The ability of LP590 to environmental tolerance（52℃，4℃，ethanol，oxygen，and osmotic stresses）were assessed.LP590 had similar tolerance to LP in 4℃and ethano（l20%）within 240min.Notably，LP590 can more tolerate of high temperature（52℃），H2O（22%）and NaC（l4.0mol/L）than LP.The above results indicated that GM LP590 had many good biological characteristics and good prospects for industrial applications.lt was a useful and comprehensive exploration to establish a new evaluation model in vitro for genetically modified micro-organisms.

Lactobacillus；genetically modified Lactobacillus；tolerance in vitro

TS201.2

A

1002-0306（2011）02-0104-03

2010-10-14 *通訊聯系人

劉海燕（1977-），女，博士研究生，研究方向：食品營養與安全。

國家轉基因生物新品種培育重大專項課題（2008ZX08011-005，2009ZX08011-011B）。