高效液相色譜-串聯質譜法測定減肥保健食品中非法添加藥物苯佐卡因

馬 微，代漢慧，張英春，陳冬東，王海波，柳彩云，王秀君，唐英章

（1.黑龍江出入境檢驗檢疫局，黑龍江哈爾濱150086；2.中國檢驗檢疫科學研究院，北京100123；3.哈爾濱工業大學食品科學與工程學院，黑龍江哈爾濱150090）

高效液相色譜-串聯質譜法測定減肥保健食品中非法添加藥物苯佐卡因

馬 微1，代漢慧2，張英春3，陳冬東2，王海波1，柳彩云2，王秀君2，唐英章2

（1.黑龍江出入境檢驗檢疫局，黑龍江哈爾濱150086；2.中國檢驗檢疫科學研究院，北京100123；3.哈爾濱工業大學食品科學與工程學院，黑龍江哈爾濱150090）

建立了測定減肥保健食品中非法添加藥物苯佐卡因的高效液相色譜-串聯質譜分析方法。減肥咖啡、減肥茶、減肥膠囊、減肥片劑、減肥餅干等不同類型的減肥保健食品經超聲萃取后，以Waters Atlantis T3柱（150mm×2.1mm，3μm）分離后，采用多反應監測（MRM）正離子模式檢測，定性離子對為m/z166與m/z138和m/z166與m/z94，采用m/z166與m/z138進行定量。實驗結果表明，苯佐卡因在0.01～50μg/L的范圍內呈良好的線性關系，相關系數為0.9985，在低、中、高的3個添加水平范圍內的平均回收率為69.3%～95.6%。同時研究了苯佐卡因的電噴霧電離質譜特征，推測其裂解途徑。本方法靈敏度高，操作簡便，可用于不同減肥保健食品中非法添加苯佐卡因的檢測。

高效液相色譜-串聯質譜，超聲萃取，苯佐卡因，質譜裂解途徑

苯佐卡因是一種非中樞性的食欲抑制藥，分子式為C9H11NO2，其分子結構如圖1所示。它可以使口腔及腸胃黏膜麻木，通過影響味覺來抑制食欲，從而達到減肥的功效。然而，一些不法廠商為了追求療效，在減肥保健食品中添加了這種藥物，長期服用苯佐卡因會帶來很大不良反應，美國FDA報道了苯佐卡因容易引起高鐵血紅蛋白血癥，且有報道該藥可使過敏體質患者發生局部或全身性的過敏反應［1］。因此，迫切要求建立一種標準檢驗方法對減肥保健食品中的非法添加藥物苯佐卡因進行監督和控制。對于減肥保健食品中苯佐卡因的檢測方法，目前尚無國家標準，國內外公開報道的紫外分光光度法［2-3］、化學發光法［4］、氣相色譜法［5］和高效液相色譜法［6-10］等，主要針對藥物制劑、體液和組織中的檢測，沒有報道在食品中的檢測，且沒有通過質譜方法進行確證研究。本實驗針對不同基質的減肥保健食品，采用超聲波萃取技術進行提取，利用串聯四極桿質譜的高選擇性、高靈敏度的優勢，建立了減肥保健食品中苯佐卡因的的高效液相色譜-串聯質譜分析方法。

圖1 苯佐卡因的化學結構式

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

苯佐卡因 德國Dr Ehrenstorfer Gmbh；甲醇HPLC級，美國Fisher公司；氮氣、氬氣 ＞99.999%；實驗用水 經Milli-Q凈化系統（0.22μm過濾膜）過濾的去離子水；其它試劑 均為分析純，北京化工廠。

ACQUITY超高效液相色譜議、XEVO三重四級桿質譜儀、Waters micromass四極桿飛行時間高分辨質譜儀、MassLynx數據處理系統 美國Waters公司；KQ-600B型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；MS2型漩渦振蕩器 德國IKA公司；Milli-Q超純水器 美國 Millipore公司；Acrodisc GHP雙性濾膜 美國Pall公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜條件 Waters Atlantis T3柱（150mm× 2.1mm，3μm）；流動相：甲醇∶水，梯度洗脫：0～8min，20%～95%甲醇；8～9min，95%～20%甲醇；9～12min，20%甲醇；流速0.2mL/min，柱溫30℃；樣品室溫度20℃；進樣量為5μL。

1.2.2 三重四極桿質譜條件 電噴霧離子源；正離子掃描；毛細管電壓3.5kV；射頻透鏡電壓0.5V；離子源溫度150℃；去溶劑氣溫度500℃；去溶劑氣流量800L/h；錐孔氣流量50L/h；光電倍增器電壓650V；碰撞氣體為氬氣，碰撞氣壓2.8×10-4Pa，多反應監測（MRM）模式檢測，質譜分析參數見表1。

表1 苯佐卡因的質譜分析參數

1.2.3 四極桿-飛行時間高分辨質譜條件 電噴霧離子源（ESI）；采用正離子模式檢測；毛細管電壓3.0kV；離子源溫度100℃；去溶劑氣溫度350℃；去溶劑氣流量600L/h；錐孔氣流量50L/h；碰撞氣體為氬氣；微通道板電壓1800V，每0.1s采集一次譜圖，質量掃描范圍m/z100～500。

1.2.4 標準溶液的配制 精密稱取苯佐卡因10.0mg，用甲醇溶解并稀釋，配制成濃度為1.0g/L的標準儲備溶液，-18℃冰箱保存備用。臨用時，用甲醇稀釋上述標準儲備溶液，配制成不同濃度的標準工作液。

1.2.5 樣品制備 精密稱取不同減肥保健食品試樣0.5g置于25mL比色管中，準確加入25.0mL甲醇，渦旋混勻，超聲提取15min后，過0.22μm有機微孔濾膜后上機測定。

2 結果與討論

2.1 色譜條件的優化

本實驗首先比較研究了甲醇∶水、乙腈∶水以及加入0.1%、0.2%甲酸，5、10mmol/L乙酸銨等二元溶劑體系作為流動相時，苯佐卡因的儀器響應信號和色譜峰形選擇性，結果表明甲醇-水為流動相時苯佐卡因的質譜響應信號較高。又進一步比較研究了等度洗脫和梯度洗脫對苯佐卡因色譜峰形的影響，結果表明梯度洗脫獲得了最優的色譜分離效果，且得到基線平穩、對稱、尖銳的峰形，如圖2所示。

圖2 苯佐卡因的MRM圖

2.2 質譜條件的優化及裂解規律的研究

選用ESI+作為離子化模式，采用流動注射泵連續進樣方式進行質譜條件的優化。對苯佐卡因的標準溶液進行四極桿-飛行時間質譜儀二級譜圖（見圖3）分析，苯佐卡因（m/z166）的二級質譜碎片主要有m/z138、120、94、177。根據歐盟2002/657/EC指令規定對于質譜確證方法必須達到4個確證點的要求，低分辨液相色譜-質譜聯用儀檢測應在確定母離子的基礎上選擇兩個以上的子離子［11］。選擇離子豐度高、基線噪音低的離子對 m/z166和 m/z138，m/z166和m/z94做為監測離子對（定性離子），選擇離子豐度最高的m/z166和m/z138做為定量離子。

圖3 苯佐卡因的二級質譜圖

根據苯佐卡因的二級質譜圖和電離噴霧電離的特點，推測出質譜裂解規律，如圖4所示。由于分子離子m/z166受羰基氧原子的作用，易在酰基處發生斷裂，生成豐度最高的碎片離子m/z138；由于電離噴霧這種軟電離技術容易丟失中性小分子，如：H2O、CO2等［12］，離子m/z138脫掉一分子CO2生成碎片離子m/z94；也可以脫掉一分子H2O生成碎片離子m/z120；隨著碰撞能量的加大，離子m/z94脫掉側鏈NH3生成碎片離子m/z77。

圖4 苯佐卡因的質譜裂解途徑

2.3 基質效應

電離噴霧離子化效率容易受樣品基質的影響。本實驗用離子抑制率，即基質空白中添加監控離子響應強度比標準溶液中相應監控離子響應強度減少的百分比，來表述樣品基質對監控離子響應強度的抑制作用，結果見表2。以減肥咖啡、減肥茶、減肥膠囊、減肥片劑、減肥餅干等為基質空白，分別添加1.0mg/kg苯佐卡因標準品，與1.0mg/kg苯佐卡因標準品比較，進行監控離子抑制率實驗。結果發現在減肥咖啡、減肥茶中由于存在大量的多酚和堿類物質等成分而對苯佐卡因電噴霧離子化效率有一定的干擾，因此，對于減肥咖啡、減肥茶的樣品需要在其基質上配制標準曲線。

表2 不同樣品基質對苯佐卡因的抑制作用

2.4 標準工作曲線和線性范圍

在選定的色譜條件和質譜條件下對一系列標準工作溶液分別進樣5μL，平行測定3次。以苯佐卡因的峰面積（Y）為縱坐標，苯佐卡因的質量濃度（X）為橫坐標進行回歸分析，由實驗得出苯佐卡因在質量濃度0.01～50μg/L的范圍內呈線性關系，回歸方程為Y=26836.7X-3018.82，相關系數為0.9985，逐級稀釋苯佐卡因標準溶液，以10倍信噪比為基準，儀器的定量限（LOQ）為0.03μg/L，以信噪比為3估算檢出限（LOD）為0.01μg/L。

表3 不同基質減肥保健品中苯佐卡因添加回收率結果（n=6）

2.5 添加回收率實驗

回收率實驗針對減肥咖啡、減肥茶、減肥膠囊、減肥片劑、減肥餅干等不同類型的減肥保健食品設定了3個添加濃度，每個濃度進行6次重復，結果見表3。

2.6 樣品測定

應用本方法對30種不同基質類型減肥保健食品進行了分析測定，均未檢出含有苯佐卡因。

3 結論

本文建立了不同基質類型的減肥保健食品中非法添加苯佐卡因的準確定性和定量檢測方法。該方法前處理簡便、不需濃縮、結果準確，符合現代分析技術的發展趨勢。

［1］孫玉，沈良駿.苯佐卡因高分子載體藥物及其納米微球的合成［J］.合成化學，2007，15（3）：382-384.

［2］Paschoal L R，Ferreira W A.Simultaneous determination of benzocaine and cetylpiridinium chloride in tablets by firstderivative spectrophotometric method［J］.Farmaco，2000，55（11）：687-693.

［3］Manuel Carmona，Manuel Silva，Dolores Pérez-Bendito.A selective and sensitive kinetic method for the determination of procaine and benzocaine in pharmaceuticals［J］.Pharmaceutical and Biomedical Analysis，1992，10（2）：145-152.

［4］Hana Paseková，Miroslav Poláek.Determination of procaine，benzocaine and tetracaine by sequential injection analysis with permanganate-induced chemilumi-nescence detection［J］. Talanta，2000，52（1）：67-75.

［5］Thomas A B，Nuray Asral，Joseph A.Simultaneous，stabilityindicating capillary gas chromatographic assay for benzocaine and the two principal benzyl esters of Balsam Peru formulated in a topical ointment［J］.Chromatography A，1992，623（2）：395-398.

［6］Sadana G S，Ghogare A B.Simultaneous determination of chloramphenicol and benzocaine in topical formulations by highperformance liquid chromatography［J］.Chromatography A，1991，542（2）：515-520.

［7］Pérez-Lozano P，García-Montoya E，Orriols A，et al.A new validated method for the simultaneous determination of benzocaine，propylparaben and benzyl alcohol in a bioadhesive gel by HPLC［J］.Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2005，39（5）：920-927.

［8］Annamaria Szoke，William L Hayton，Irvin R，et al. Quantification of benzocaine and its metabolites in channel catfish tissues and fluids by HPLC［J］.Pharmaceutical and Biomedical Analysis，1997，16（1）：69-75.

［9］Jeffery R Meinertz，Guy R Stehly，Terrance D Hubert，et al. Liquid chromatographic determination of benzocaine and N-acetylbenzocaine in the edible fillet tissue from rainbow trout［J］. Chromatography A，1999，855（1）：255-260.

［10］Bárbara Gigante，Ana M V Barros，Adriano Teixeira，et al. Separation and simultaneous high - performance liquid chromatographic determination of benzocaine and benzyl benzoate in a pharmaceutical preparation［J］.Chromatography A，1991，549（1）：217-220.

［11］Commission of the European Communities.Implamenting council directive 96/23/EC concerning the performance of analytical methods and the interpretation of results，2002/657/EC［EB/OL］.http：//www.wetgiw.gov.pl/old/U E/p raw o/02_657/ e02657.pdf.

［12］王光輝，熊少祥.有機質譜解析［M］.北京：化學工業出版社，2005.

HPLC-MS/MS determination of illegal drug benzocaine added in weight-loss functional foods

MA Wei1，DAI Han-hui2，ZHANG Ying-chun3，CHEN Dong-dong2，WANG Hai-bo1，LIU Hai-yun2，WANG Xiu-jun2，TANG Ying-zhang2
（1.Heilongjiang Entry-Exist Inspection and Quarantine Bureau，Haerbin 150086，China；2.National Academy of Inspection and Quarantine，Beijing 100123，China；3.Food Science and Engineering College of Harbin Institute of Technology，Harbin 150090，China）

A comprehensive analytical method based on high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry was developed for the determination of benzocaine.Various weight-loss functional foods，including weight-loss coffee，tea，capsule，tablet and biscuit were extracted under ultrasonication and were separated on Waters Atlantis T3（150mm ×2.1mm，3μm）column.Benzocaine was detected by MS/MS technique using positive electrospray ionization and multiple reaction monitoring（MRM）mode，and employing two precursor-product ion pairs：m/z166 and m/z 138，m/z166 and m/z 94，as qualitative ion pairs，m/z166 and m/z 138 as quantification ion pairs.The results showed that the calibration curve showed good linearity for benzocaine in the ranges of 0.01～50μg/L，and the correlative coefficient was 0.9985.The mean recoveries at the three spiked levels（low，middle，high）were 69.3%～95.6%.The mass spectrum characterization of benzocaine and speculated on fragmentation pathways were also studied.The method is sensitive，simple and adapt to the determination of benzocaine in the different weight-loss functional foods.

HPLC-MS/MS；ultrasonication extraction；benzocaine；mass spectrum fragmentation pathways

TS207.3

A

1002-0306（2011）02-0353-04

2009-11-16

馬微（1978-），女，博士，工程師，研究方向：食品安全。

國家科技支撐計劃農業領域課題（2006BAD27B02）。