葵花粕中綠原酸檢測方法的建立

胡鮮寶，呂加平，劉 鷺，范貴生，張書文，閆 坤，謝躍杰

（1.中國農業(yè)科學院農產品加工研究所，北京100193；2.內蒙古農業(yè)大學食品科學與工程學院，內蒙古呼和浩特010018）

葵花粕中綠原酸檢測方法的建立

胡鮮寶1，2，呂加平1，*，劉 鷺1，范貴生2，張書文1，閆 坤1，謝躍杰1

（1.中國農業(yè)科學院農產品加工研究所，北京100193；2.內蒙古農業(yè)大學食品科學與工程學院，內蒙古呼和浩特010018）

在分析高效液相色譜法（HPLC）和紫外分光光度法（UV）的基礎上，通過運用Origin8.0數(shù)據(jù)處理分析軟件，建立了一種快速、有效、準確的葵粕綠原酸（CGA）檢測方法。結果表明：這兩種方法測定的已知濃度CGA的含量符合方程：Y=1.386+0.4082X+0.0132X2-8.438X3，R2=0.9856，其中X為UV測定結果，Y為HPLC測定結果，并通過驗證，在5.5～33μg/mL濃度范圍內，該方程準確可靠，從而可以實現(xiàn)UV法快速、準確地測量大批量樣品中的CGA含量。

綠原酸，UV法，HPLC法，檢測

綠原酸（CGA）又名咖啡鞣酸，是植物在有氧呼吸過程中產生的一種由咖啡酸（caffiec acid）與奎尼酸（quinic acid）組成的酯類物質［1］，分子式C16H18O9，分子量345.30［2］。綠原酸具有較強的藥理活性，它具有預防II型糖尿病和心血管疾病的功能［3-4］。而且據(jù)報道，綠原酸有抗病毒、抗細菌和抗真菌作用，并且毒副作用較低［5-7］。綠原酸主要存在于杜仲葉、金銀花和向日葵中，據(jù)報道向日葵栽培品種中綠原酸含量為1.1%～4.5%，平均為2.8%［8］，我國有豐富的葵粕資源，對葵粕中綠原酸進行研究，不僅可以促進向日葵資源的綜合開發(fā)利用，而且可解決向日葵產區(qū)葵粕積壓問題。隨著對CGA研究廣泛、深入的開展，進行CGA分析檢測是各項研究開展的前提和基礎。目前國內外定性和定量分析CGA的方法主要有紫外分光光度法（UV）、高效液相色譜法（HPLC）、熒光光度法、薄層色譜掃描法和毛細管電泳法（CE），其中UV法和HPLC法是最為常用和經(jīng)典的分析方法。HPLC法具有高靈敏度、高準確度和高分離效果，但是比較費時并且費用較高，不適合常規(guī)檢測。UV法價格便宜，操作簡便快速，國內有好多學者利用UV分析CGA，但是該法易受各種雜質的干擾，造成測定結果誤差較大。因此，亟待建立一種客觀、快速、簡便的測定方法，本研究試圖采用UV和HPLC相結合的方法對CGA含量進行測定，并通過曲線擬合，建立數(shù)學模型，用HPLC測定的結果對UV進行修正，為后續(xù)研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

葵花仁 內蒙古恒信商業(yè)有限責任公司；石油醚 天津市永大化學試劑開發(fā)中心；乙醇 北京化工廠；去離子水 中國農業(yè)大學；綠原酸標準品Sigma公司。

UV2300紫外分光光度計 上海天美科學儀器有限公司；6410液相色譜-質譜連用儀 配有電噴霧離子源（ESI），美國Agilent科技公司；Anke LXJ-IIB離心機 上海安亭科學儀器廠；DK-S24型電熱恒溫水浴鍋 上海森信實驗儀器有限公司；JA2003N電子天秤 上海精密科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 葵粕中綠原酸的提取 葵花籽→粉碎→浸提去油→濕粕低溫干燥→醇提→過濾→離心→檢測

1.2.2 最大吸收波長的測定 將綠原酸標準溶液配制成濃度為 0.05mg/mL，用紫外分光光度計在200～1000nm掃描，由計算機讀出最大吸收波長。

1.2.3 液質連用（HPLC-MS）對提取物中的綠原酸進行定性分析

1.2.3.1 色譜條件 色譜柱：ZORBAX SB-C18（2.1× 30mm，3.5μm）；柱溫：35℃；進樣量：2μL；流動相：0.5%乙酸溶液∶乙腈=90∶10。

1.2.3.2 質譜條件 電噴霧電離源（ESI）；負離子檢測；流速：0.3mL/min；噴霧壓力：120V；掃描方式（SIM模式）；m/z：354。

1.2.4 綠原酸紫外檢測方法的建立

1.2.4.1 標準曲線的制備 精密稱定綠原酸標準品5mg，用95%乙醇定容到50mL，搖勻后，取0.5、0.75、1.0、1.25、2.0、2.5mL分別置于10mL容量瓶中，并且用95%乙醇稀釋到刻度。以95%乙醇為參比液，在327nm處測定各濃度的吸光值A。以綠原酸標準品濃度C為橫坐標，以其吸光度為縱坐標繪圖，得回歸方程。

1.2.4.2 回收率的測定 在樣品制備液中加入一定濃度的綠原酸標準溶液，在已經(jīng)測定的最大吸收波長處測定吸光度OD，根據(jù)回歸方程計算回收率。B=A1/A2（式中：B-回收率，A1-實測量，A2-加入量）采用加樣回收法。取適量已知含量的同一批號樣品，分別精密加入一定量的綠原酸對照品，依方法操作測定，同法重復實驗5次，測得綠原酸的平均回收率。

1.2.5 綠原酸高效液相色譜檢測方法的建立

1.2.5.1 液相色譜條件 色譜柱：C18柱（250mm× 4.6mm，5μm）；流動相：0.5%乙酸溶液∶乙腈=90∶10；流速：1.0mL/min；柱溫：35℃；檢測波長：327nm；進樣量：10μL。

1.2.5.2 標準曲線方程 稱取綠原酸標準品0.02g（精確至0.0001g）于100.0mL容量瓶中，加流動相溶解并定容至刻度，混勻，此標準使用液在4℃冰箱中儲存，分別吸取此標準使用液，用流動相稀釋并在容量瓶中定容的濃度分別為 2.0、10.0、20.0、40.0、80.0μg/mL標準系列，以綠原酸標準品濃度C為橫坐標，以其吸光度為縱坐標繪圖，得回歸方程。

1.2.5.3 回收率實驗 采用1.2.4.2所用回收率測定方法。

1.2.6 擬合方程的建立 在UV檢測方法和HPLC檢測方法的基礎上，以CGA標準品為檢測樣品，通過運用Origin8.0數(shù)據(jù)處理分析軟件，建立UV測定結果與HPLC測定結果之間的數(shù)學模型。

2 結果與分析

2.1 最大吸收波長的測定

在200～1000nm對CGA標準品掃描，從圖1可以看出，CGA在327nm處有最大吸收峰。

2.2 綠原酸定性分析

為了對提取物中的綠原酸進行定性分析，采用負離子檢測，建立綠原酸定性分析方法，其質譜采用SIM模式，在m/z為354處有比較強的響應，根據(jù)其質譜特征，可以判斷該組分為綠原酸，圖2和圖3分別為葵粕提取液和標準品SIM譜圖。

圖1 標準液UV掃描圖

圖2 葵粕綠原酸提取液SIM圖譜

圖3 綠原酸標準品SIM譜圖

2.3 UV法對CGA的測定

根據(jù)朗伯比爾定律，在一定濃度范圍內吸光度值與樣品濃度成正比，由圖4可知，CGA濃度在0.01～0.03mg/mL時有良好的線性關系，并求得線性回歸方程為Y=0.0169X+0.0002，R2=0.9952。通過表1可知UV法的平均加樣回收率為1.16%，可見UV法具有一定的準確度。

圖4 UV法測CGA標準曲線

表1 UV法CGA回收率表

2.4 HPLC法對CGA的測定

通過計算得HPLC法測定葵花粕中CGA線性方程為：Y=0.09946+0.22857X，R=0.99984，方程顯著性水平是0.0001。并且由圖5可知，CGA在2～80μg/mL的濃度范圍內是線性相關的，并且具有良好的線性關系。通過表2可知，HPLC法的平均加樣回收率為95.8%，說明HPLC法比較準確和可信。

圖5 HPLC法測CGA標準曲線

表2 HPLC法CGA回收率表

2.5 擬合曲線的建立

為了找到HPLC法和UV法測定結果之間的關系，采用了線形擬合、指數(shù)擬合和多項式擬合的方法，線性擬合見圖6，擬合方程為：Y=0.9738X-3.8567，R2=0.9849，其中X軸為UV測定結果，Y軸為HPLC測定結果。指數(shù)擬合見圖7，其擬合方程為Y=y0+Ae-x/t，y0=-2.01327E7，A=2.01327E7，t= -2.06734E7，R2=0.98357。多項式擬合見圖8，其方程為Y=A+BX+CX2+DX3，A=1.386，B=0.4082，C=0.0132，D=-8.434，R2=0.9856。從上述擬合結果可以看出，HPLC法和UV法所測得結果存在差異，并且在一定的范圍內，UV所測得結果要大于HPLC所測得的結果，其主要原因是在UV測量的過程中，除了綠原酸以外，其他的酚類物質在327nm處也有吸收，從而為UV測定帶來了誤差，為了提高UV測定法的準確性，采用Origin8.0對這兩種方法進行擬合，結果表明多項式擬合的相關系數(shù)（R2=0.9856）略高于線性擬合（R2=0.9849）以及指數(shù)擬合（R2= 0.98357），由此選 Y=1.386+0.4082X+0.0132X2-8.438X3為最佳擬合方程。

圖6 線性擬合圖

2.6 擬合方程的驗證

在以CGA標準品為檢測樣品建立了擬合方程后，利用UV法對醇提液中的CGA進行測定，經(jīng)擬合方程校正CGA的含量，并通過HPLC對計算結果進行驗證，結果表明在一定的濃度范圍內（5.5～33μg/mL），樣品經(jīng)擬合方程校正的濃度值與HPLC法所測得的結果相近，t檢驗的結果表明，在0.05水平下，兩組數(shù)據(jù)之間沒有顯著差異（p=0.6722）。

圖7 指數(shù)擬合圖

圖8 三次多項式擬合圖

紫外分光光度法是一般常規(guī)實驗室常采用的檢測方法。但是提取液中成分復雜多樣，存在各種雜質的干擾，造成測定結果誤差很大。高效液相色譜法以其高速、高效、高靈敏度等優(yōu)點在檢測應用中逐漸增多，但缺點是利用HPLC檢測需要時間較長，并且成本較高。國內一些學者雖然對紫外可見分光光度法和高效液相色譜法對綠原酸的含量的測定有過研究和比較［9］，但是卻沒有對UV測定進行校正，本研究給出UV法測定CGA含量的擬合方程，方程表明，在一定濃度范圍內（5.5～33μg/mL），該方程準確可靠，從而可以實現(xiàn)UV法快速、準確地測量大批量樣品中的CGA含量。在實際操作中，建議將CGA濃度控制在推薦的范圍內，如果濃度過低或過高，需要適當?shù)貪饪s或稀釋，以確保實驗結果的準確性。

表3 多項式擬合結果驗證

3 結論

3.1 建立了CGA的UV檢測方法，當CGA濃度在0.01～0.03mg/mL時有良好的線性關系，并求得線性回歸方程為Y=0.0169X+0.0002，R2=0.9952。

3.1 建立了 CGA的 HPLC檢測方法，CGA在2～80μg/mL的濃度范圍內是線性相關的，線性方程為Y=0.09946+0.22857X，R=0.99984，方程顯著性水平是0.0001。

3.3 在線性、指數(shù)、三次多項式曲線擬合的方法中，多項式擬合Y=1.386+0.4082X+0.0132X2-8.438X3為最佳擬合方程，其中Y為HPLC測定值，X為UV測定值，R2=0.9856。并且在5.5～33μg/mL濃度范圍內，樣品經(jīng)擬合方程換算成的濃度與HPLC測定結果相近，并在0.05水平下，兩組數(shù)據(jù)之間沒有顯著差異（p=0.6722）。

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Study on chlorogenic acid determination method from sunflower seed meal

HU Xian-bao1，2，LV Jia-ping1，*，LIU Lu1，F(xiàn)AN Gui-sheng2，ZHANG Shu-wen1，YAN Kun1，XIE Yue-jie1
（1.Institute of Agro-food Science and Technology，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193，China；2.Food Science and Engineering Department，Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot 010018，China）

ln order to create a kind of quickly，effective and precise chlorogenic acid（CGA）determination method，on the basis of HPLC and UV methods，Origin8.0-statistical analysis software was adopted to build a fitted equation with HPLC results as Y value，and with UV result as X value.The equation was obtained as：Y=1.386+ 0.4082X+0.0132X2-8.438X3，R2=0.9856.According to confirmatory test results，in the 5.5～33μg/mL concentration range，the fitted equation was precise and reliable.And so the modified UV method can determine CGA quickly，precisely and with large quantities.

chlorogenic acid；UV method；HPLC method；determination

TS207.3

A

1002-0306（2011）02-0341-04

2010-03-09 *通訊聯(lián)系人

胡鮮寶（1984-），男，碩士研究生，研究方向：農產品加工。

中國農業(yè)科學院作物科學研究所中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務費專項資助項目。