液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定魚肉中的七種全氟有機(jī)物

羅海英，蔡依軍，冼燕萍，吳玉鑾，郭新東，陳意光

（廣州市質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)研究院，國(guó)家加工食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心（廣州），廣東廣州510110）

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定魚肉中的七種全氟有機(jī)物

羅海英，蔡依軍，冼燕萍，吳玉鑾，郭新東，陳意光

（廣州市質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)研究院，國(guó)家加工食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心（廣州），廣東廣州510110）

建立了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)魚肉中七種全氟有機(jī)物殘留的分析方法。通過優(yōu)化和比較，樣品選用甲醇均質(zhì)提取，C18固相萃取小柱凈化，以乙腈-5mmol/L乙酸銨為流動(dòng)相經(jīng)C8反相色譜柱分離后，采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）負(fù)離子模式檢測(cè)。陰性樣品添加實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，特征離子相對(duì)強(qiáng)度比值穩(wěn)定，基質(zhì)效應(yīng)干擾少，結(jié)合保留時(shí)間可實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確的定性定量，方法檢出限為0.01～0.03μg/kg（S/N=3），不同魚肉基質(zhì)樣本添加水平在0.05～1.0μg/kg時(shí)，平均回收率為80.0%～120.0%，相對(duì)偏差（n=6）為2.9%～7.6%。

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜，魚，全氟有機(jī)物，測(cè)定

全氟有機(jī)物（PFCs）具有化學(xué)惰性和耐熱性等優(yōu)良性能，在20世紀(jì)50年代就被廣泛用于工業(yè)品和日常生活用品。這一類物質(zhì)具有持久性、生物累積性、毒性以及能長(zhǎng)距離遷移的特性，是一種持久性的環(huán)境污染物［1］。生物體一旦攝取PFCs，很難通過生物體的新陳代謝而分解，長(zhǎng)時(shí)間接觸會(huì)對(duì)健康造成嚴(yán)重?fù)p失，最近歐洲食品安全局推薦了關(guān)于人體攝入全氟辛烷磺酸鹽（PFOS）和全氟辛酸（PFOA）的耐受量，分別為150、1500ng/（kg bw·d）［2］。目前在世界各地采集的環(huán)境樣品中，包括水源、多種野生動(dòng)物血清及組織樣品，甚至人類乳汁，都已檢測(cè)出多種的PFCs。魚類等水產(chǎn)品是人類重要的膳食成分，因此對(duì)這類樣品中PFCs的分析和控制，對(duì)于人類健康和飲食安全具有重要意義。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)PFCs的檢測(cè)方法通常為液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS/ MS）［3-7］，針對(duì)不同基質(zhì)的食品的萃取方法主要有：離子對(duì)試劑液液萃取法［3］、堿消解法［3］、酸消解法和甲醇直接提取法［4］，以弱陰離子（WAX）固相萃取小柱［8-9］凈化。離子對(duì)試劑液液萃取法一般以緩沖鹽溶液-叔丁基甲醚進(jìn)行萃取，對(duì)于含油脂較多的肉類食品，會(huì)萃取出大量的油脂，難以進(jìn)行后繼的凈化；消解法則需要16h以上的消解時(shí)間，前處理耗時(shí)長(zhǎng)；另外，WAX萃取柱需要使用酸性溶液淋洗、氨水甲醇洗脫，操作稍顯繁瑣。本研究通過對(duì)不同的提取溶劑、固相萃取凈化柱、流動(dòng)相、液相色譜柱的比較和優(yōu)化，選擇以甲醇為提取劑對(duì)肉類樣品進(jìn)行均質(zhì)提取，C18固相萃取小柱凈化，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定，建立了行之有效的魚肉中七種全氟有機(jī)物殘留的分析方法，本方法操作簡(jiǎn)便，提取效果穩(wěn)定，雜質(zhì)干擾少。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

全氟己酸（PFHxA）、全氟庚酸（PFHpA）、全氟辛酸（PFOA）、全氟壬酸（PFNA）、全氟癸酸（PFDA）、全氟十一酸（PFUnDA）、全氟辛烷磺酸鹽（PFOS）七種標(biāo)準(zhǔn)品 純度＞99.0%，sigma-aldrich；乙腈、甲醇、乙酸銨 色譜純；超純水（18.0MΩ）。

LD5-2A離心機(jī) 北京京立離心機(jī)有限公司；N-EVAP 112水浴氮吹儀 Organomation Associates公司，美國(guó)；WERKE T25 basci均質(zhì)器 廣州儀科實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司；MS2 Minshaker漩渦振蕩器 廣州儀科實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司；Milli-Q去離子水發(fā)生器 Millipore公司，美國(guó)；20孔固相萃取裝置Waters公司，美國(guó)；液質(zhì)聯(lián)用儀 Agilent 1200液相色譜系統(tǒng)和AB API 4000 Q-Trap三重四極桿質(zhì)譜（采用Turbo spray ESI電離源）；C18固相萃取小柱Phenomenex Strata C18-E，500mg/3mL，使用前加入3mL甲醇，3mL水活化。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理

1.2.1.1 提取 稱取魚肉樣品5.00g（精確至0.01g）至50mL聚丙烯離心管中，加入15mL甲醇，用均質(zhì)器于10000r/min均質(zhì)30s，再以少量甲醇洗滌刀頭，合并洗滌液。于4000r/min轉(zhuǎn)速下離心5min，過濾后定容至25mL。從中準(zhǔn)確吸取10mL提取液置于氮吹管中，置于40℃水浴吹氮至干。加入2mL水，漩渦振蕩溶解殘?jiān)齼艋?/p>

1.2.1.2 凈化 把待凈化液過C18固相萃取小柱，保持流速小于1mL/min，以3mL水沖洗小柱，棄去流出液。加入6mL甲醇洗脫，收集流出液于氮吹管中，40℃水浴吹氮至干，準(zhǔn)確加入1.0mL流動(dòng)相，漩渦振蕩溶解殘?jiān)^0.22μm有機(jī)濾膜，待測(cè)。

1.2.2 液質(zhì)聯(lián)用儀分析條件

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)工作液配制 分別稱取適量的PFCs標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇配制成單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。分別準(zhǔn)確吸取適量的PFCs單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用甲醇配制成濃度為1mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。臨用前用流動(dòng)相（60+ 40乙腈+5mmol/L乙酸銨溶液）將1mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋至所需的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2.2.2 色譜條件 色譜柱：Kromasil 100-5C8150mm×4.6mm（i.d.），5μm；流動(dòng)相：乙腈和5mmol/L乙酸銨溶液，洗脫梯度見表1；流速：0.5mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20μL。

表1 流動(dòng)相組成和梯度

1.2.2.3 質(zhì)譜條件 離子源：ESI；離子源溫度：400℃；電離電壓（IS）：-4500V；檢測(cè)模式：采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式；輔助氣、霧化氣、氣簾氣、碰撞氣：氮?dú)猓?jīng)調(diào)試為最優(yōu)值。7種PFCs的定性定量離子對(duì)見表2。

表2 PFCs的定性定量離子對(duì)

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品提取條件的優(yōu)化

參考相關(guān)文獻(xiàn)［1-6］，對(duì)樣品的提取條件進(jìn)行優(yōu)化。根據(jù)PFCs具有極性和非極性兩種基團(tuán)，本文以陰性魚肉樣品添加實(shí)驗(yàn)（即稱取陰性樣品5.00g，添加5μg/L PFCs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液1mL，于室溫下放置2h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)處理），對(duì)比了正己烷、甲醇、水三種溶劑作均質(zhì)提取。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：正己烷提取液吹氮濃縮后，得到大量的動(dòng)物油脂，影響凈化的處理；水提取液較為混濁，提取率低，凈化處理時(shí)容易堵塞SPE小柱；甲醇提取，蛋白質(zhì)變性沉淀，動(dòng)物油脂也不容易溶出，提取液澄清，吹氮濃縮后容易凈化，7種PFCs的提取率穩(wěn)定，回收率在85%～97%。所以，本文選擇了以甲醇為提取劑，對(duì)樣品進(jìn)行均質(zhì)提取。

為避免引入高背景值，實(shí)驗(yàn)全過程應(yīng)該避免使用聚四氟乙烯材質(zhì)的色譜管路和器皿，本研究所用器皿均為聚丙烯材料，色譜管路為全PEEK塑料管路。

2.2 樣品的凈化

本研究考察了HLB、MAX和C18（疏水端基封尾）三種固相萃取小柱對(duì)7種PFCs的回收情況。采用含有7種PFCs（均為2ng）的2mL水溶液過柱，然后進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，MAX回收率為零，這可能由于MAX填料中的季胺基與PFCs中的羧酸基結(jié)合緊密，2%甲酸甲醇不容易把PFCs置換洗脫下來(lái)；C18的回收率較HLB的稍高，7種PFCs的回收率均達(dá)90%左右（見表4）。本研究最終選擇C18柱作為樣品凈化的固相萃取柱。

2.3 不同液相色譜條件的比較

在本實(shí)驗(yàn)室的條件下，比較了C18和C8色譜柱。由于PFCs具有-（CF2-CF2）n-直鏈，在C18色譜柱上保留很強(qiáng)，表現(xiàn)為色譜峰保留時(shí)間過長(zhǎng)、不穩(wěn)定，拖尾嚴(yán)重；改用C8色譜柱，色譜峰拖尾現(xiàn)象有所改善，流動(dòng)相中加入乙酸銨后，峰型對(duì)稱、尖銳。

高濃度的鹽會(huì)影響目標(biāo)化合物的離子化效率，同時(shí)對(duì)質(zhì)譜儀造成損害，因此本實(shí)驗(yàn)對(duì)乙酸銨的濃度進(jìn)行優(yōu)化。研究了乙酸銨濃度分別為 5、10、20mmol/L時(shí)對(duì)各分析物在Kromasil 100-5C8色譜柱的色譜行為的影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：隨著乙酸銨濃度的增加，各分析物的保留時(shí)間稍有延長(zhǎng)，各色譜峰稍展寬，響應(yīng)值下降。所以，優(yōu)選5mmol/L乙酸銨為流動(dòng)相，8min內(nèi)即可完成7種PFCs的檢測(cè)，并得到滿意的靈敏度。

2.4 方法檢出限與線性關(guān)系

以流動(dòng)相稀釋PFCs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液至0.05、0.2、1.0、2.0、10.0μg/L，按本文儀器條件進(jìn)行檢測(cè)。以濃度x（μg/L）對(duì)峰面積y作PFCs標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，線性方程、回歸系數(shù)、方法檢出低限見表3。7種PFCs標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流色譜圖見圖1。

表3 PFCs的線性方程、回歸系數(shù)、方法定量限

表4 樣品中全氟有機(jī)物的回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）

圖1 7種全氟有機(jī)物標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流色譜圖

2.5 回收率與精密度

分別以陰性的含油脂較少的羅非魚肉和含油脂較多的鰻魚肉進(jìn)行3個(gè)水平的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。每種肉樣品的加標(biāo)量0.05～1.0μg/kg。每個(gè)加標(biāo)水平取6個(gè)平行樣，其回收率與精密度數(shù)據(jù)見表4。

3 結(jié)論

本文建立了魚肉中7種全氟有機(jī)物（PFCs）殘留的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）分析方法，該方法前處理簡(jiǎn)單、回收率高、精密度好，方法檢出限為0.01～0.03μg/kg，可適用于魚肉中7種全氟有機(jī)物（PFCs）的確證檢驗(yàn)。

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Determination of seven perfluorinated compounds in fish by liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry

LUO Hai-ying，CAI Yi-jun，XIAN Yan-ping，WU Yu-luan，GUO Xin-dong，CHEN Yi-guang
（Guangzhou Quality Supervision and Testing Institute，National Center for Quality Supervision and Testing of Cosmetics（Guangzhou），Guangzhou 510110，China）

A high performance liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometric（HPLCESl-MS/MS）method was established for the determination of 7 perfluorinated compounds（PFCs）in fish.The sample was extracted with methanol and cleaned up by C18SPE cartridges.7 PFCs were separated on a C8reversed-phase column using gradient elution with acetonitrile and 5mmol/L ammonium acetate.The tandem mass spectral acquisition was done in the negative electrospray ionization utilizing multiple reaction monitoring.Analysis of blank and fortified samples showed that the relative intensity of the PFCs identification ion pairs in various matrices was stable.Combining with retention time，the method could be used for accurate qualitative analysis.The LOD（S/N=3）was 0.01～0.03μg/kg.At the spiking levels of 0.05～1.0μg/kg，the average recoveries were 80.0%～120.0%，and the RSD for repeated measurements（n=6）was between 2.9%and 7.6%.

HPLC-MS/MS；fish；perfluorinated compounds（PFCs）；determination

TS207.3

A

1002-0306（2011）02-0325-04

2010-08-17

羅海英（1976-），女，高工，主要從事檢測(cè)技術(shù)研究工作。

國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局科技計(jì)劃項(xiàng)目（2008QK264）。