氣相色譜分析多糖衍生化方法的研究與比較

白娣斯，張 靜

（陜西師范大學食品工程與營養科學學院，陜西西安710062）

氣相色譜分析多糖衍生化方法的研究與比較

白娣斯，張 靜*

（陜西師范大學食品工程與營養科學學院，陜西西安710062）

采用糖腈衍生化和糖醇衍生化兩種方法分析多糖組分，找出線性關系，計算摩爾比，測定加樣回收率、精密度、重復性等。糖醇衍生化中，果糖經過還原可得到山梨醇和甘露醇的混合物，測定結果容易導致色譜峰的混亂，不易定性分析，并且衍生化方法反應時間較長，操作比較麻煩。糖腈乙酸酯衍生物氣相色譜法具有衍生物制備簡便、試劑易得等優點，并且每種糖都能得到單一的色譜峰。通過對氣相色譜糖腈衍生化法和糖醇衍生化法的研究和比較，表明糖腈衍生化方法是氣相色譜研究食品多糖較為合適的衍生化方法。

多糖，氣相色譜，糖腈乙酰酯衍生法，糖醇醋酸鹽衍生法

近年來，人們致力于研究多糖的生理活性和它的化學結構方面的關系，從更深層次探討多糖的作用機制。有關多糖立體構型的改變、分子量變化、重復結構單位主側鏈的類型以及主側鏈分子比例、降解或引進基團等因素對多糖生理活性影響的研究己有相關報道［1-3］。氣相色譜是多糖結構分析中最重要的手段之一，測定糖類具有選擇性好、樣品用量少、分辨率強、靈敏度高、分析速度快以及可用于定性及定量分析等優點［4］。氣相色譜要求試樣具有良好的揮發性和熱穩定性。中藥多糖為生物大分子物質，由于含大量羥基不能在高溫下直接揮發，不適用于氣相色譜，因而在研究中藥多糖中需要將大分子多糖降解為單糖或寡糖，并且將其衍生成易揮發，且熱穩定的衍生物。本實驗研究了兩種衍生化方法，通過對多糖的定性定量分析以及重復性、回收率的測定，比較這兩種衍生化方法的優劣，從而建立一種較好的適用于中藥多糖的氣相色譜衍生化方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樣品 南瓜皮粗多糖APP以及用CTAB法分離得到的南瓜皮多糖APP1和APP2；D-果糖 Shanghai Green Rird Technology Devel.Ltd.；D-半乳糖 上海恒信化學試劑有限公司；D-甘露糖、D-木糖 中國醫藥（集團）上海化學試劑公司；D-核糖 北京鼎國生物技術發展中心；葡萄糖 天津市科密歐化學試劑開發中心；吡啶、鹽酸羥胺、硼氫化鈉、乙酸、三氟乙酸等試劑 均為分析純。

TDL80-2B飛鴿牌系列離心機 上海安婷科學儀器廠制造；Trace GC氣相色譜儀 美國菲尼根；RE-52AA旋轉蒸發器，ACQ-600超聲波發生器，LXJ -ⅡB型低速大容量多管離心機，Christ ALPH1-4真空冷凍干燥機。

1.2 標準單糖糖腈衍生化［5］

準確稱取各種標準單糖10mg，分別加入10mg的鹽酸羥胺，用0.5mL的吡啶溶解后封管，在90℃水浴中反應30min，冷卻至室溫加入0.5mL無水醋酸酐封管后于90℃水浴中反應30min，反應物直接進行氣相色譜分析。

1.3 標準單糖糖醇衍生化［5］

準確稱取各種標準單糖10mg，加入30mg硼氫化鈉，加入2mL水振蕩后，在室溫下放置至少1.5h，使糖還原成相應的糖醇，滴入醋酸分解過量的硼氫化鈉，至無氣泡產生為止。溶液在60℃下減壓濃縮至干，加入0.1%（V/V）鹽酸甲醇溶液2mL，振蕩后加壓蒸發至干，重復四次以除去硼酸根，剩余物在105℃烘箱中加熱15min除去水分。加入0.5mL吡啶和0.5mL醋酸酐，封管后在沸水浴中反應1h，反應物進行氣相色譜分析。

1.4 標準曲線

1.4.1 糖腈衍生化法標準曲線 準確稱取500mg肌醇六乙酰酯，用無水吡啶溶解并定容于50mL容量瓶中作為內標。精確稱取各標準單糖阿拉伯糖、鼠李糖、核糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖各10、15、20、25、30mg，用無水吡啶溶解并定容于5mL容量瓶中，分別吸取各標準單糖0.6mL于具塞試管中，分別加入內標溶液0.1mL和10mg的鹽酸羥胺，各管以無水吡啶補至1.0mL，溶解后封管，在90℃水浴中反應30min，冷卻至室溫加入0.5mL無水醋酸酐封管后于90℃水浴中反應30min進行乙酰化，冷卻后用氯仿萃取3次，合并氯仿層，減壓抽干后加入1mL氯仿溶解進行氣相色譜分析。以每種單糖進樣前濃度為橫坐標，單糖與內標的峰面積比為縱坐標作線性回歸，計算出回歸方程與相關系數。

1.4.2 糖醇衍生化法標準曲線 準確稱取500mg肌醇六乙酰酯，用無水吡啶溶解并定容于50mL容量瓶中作為內標。精確稱取各標準單糖阿拉伯糖、鼠李糖、核糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖各10、15、20、25、30mg，用蒸餾水溶解并定容于5mL容量瓶中，分別吸取各標準單糖0.6mL于具塞試管中，分別加入3.6、5.4、7.2、9.0、10.8mg NaBH4還原，加入1.4mL蒸餾水，使其體積均為2mL。在室溫下放置至少1.5h，使糖還原成相應的糖醇，滴入醋酸分解過量的硼氫化鈉，至無氣泡產生為止。溶液在60℃下減壓濃縮至干，加入甲醇2mL，振蕩后加壓蒸發至干，重復四次以除去硼酸根，剩余物在105℃烘箱中加熱15min除去水分。加入0.5mL吡啶和0.5mL醋酸酐，封管后在沸水浴中反應1h，反應物進行氣相色譜分析。以每種單糖進樣前濃度為橫坐標，單糖與內標的峰面積比為縱坐標作線性回歸，計算出回歸方程與相關系數。

1.5 肌醇六乙酰酯的制備

稱取3g肌醇，加入4.5g鹽酸羥胺、45mL醋酸酐和3mL吡啶，在90℃水浴中加熱2h，并不斷攪拌，將反應液冷卻至室溫后倒入50mL冰水中，使肌醇六乙酰酯析出，過濾后加20mL水洗滌，將壓干后產物放入100℃烘箱中烘干備用。氣相色譜檢測肌醇六乙酰酯為單峰。

1.6 氣相色譜條件

OV-17毛細管柱；FID檢測器；升溫程序：150℃（7℃/min）→190℃（15℃/min）→250℃；進樣口溫度280℃；檢測器溫度260℃；Air：H2∶N2=300∶30，載氣流速10mL/min；進樣量0.1μL。

1.7 多糖組分的定性分析

1.7.1 多糖的完全酸水解 取南瓜皮多糖5mg，置于安培管中，加入0.4mL蒸餾水溶解，再加入等體積的4mol/L三氟乙酸，封管，置于110℃水解3h，將水解液減壓蒸干，加入1.5mL甲醇溶解，再減壓蒸干，重復三次以除盡殘余的三氟乙酸，得到水解后的南瓜皮多糖。

1.7.2 多糖糖腈乙酸酯衍生物的制備 將水解后的多糖加入10mg的鹽酸羥胺，用0.5mL的吡啶溶解后封管，在90℃水浴中反應30min，冷卻至室溫加入0.5mL無水醋酸酐封管后于90℃水浴中反應30min，冷卻后用氯仿萃取3次，合并氯仿層，減壓抽干后加入1mL氯仿溶解進行氣相色譜分析。

1.7.3 多糖糖醇醋酸鹽衍生物的制備 多糖水解后，用NaBH4（15mg）還原，加入2mL蒸餾水振蕩后，在室溫下放置至少1.5h，使糖還原成相應的糖醇，滴入醋酸分解過量的硼氫化鈉，至無氣泡產生為止。溶液在60℃下減壓濃縮至干，加入甲醇2mL，振蕩后加壓蒸發至干，重復四次以除去硼酸根，剩余物在105℃烘箱中加熱15min除去水分。加入0.5mL吡啶和0.5mL醋酸酐，封管后在沸水浴中反應1h，反應物進行氣相色譜分析。

1.8 多糖組成的定量分析

1.8.1 多糖的衍生化 準確稱取水解后的南瓜皮多糖10mg，加入4mg的肌醇六乙酰酯作為內標物，然后分別按照兩種衍生化方法制備多糖衍生物。

1.9 多糖中單糖摩爾比的計算

根據各單糖的標準曲線計算出多糖中單糖的含量，各單糖的摩爾數：

式中：C為測得的單糖的濃度，L為進樣前的體積，M為該單糖的分子量。

2 結果與討論

2.1 標準單糖衍生化方法比較

采用糖腈衍生化和糖醇衍生化兩種衍生化方法進行對比，通過氣相色譜對七種單糖標品的混標進行定性分析。

圖1為混合標準單糖糖腈化衍生物的氣相色譜圖，采用這種方法衍生化后，各種單糖能完全在石英毛細管柱中很好的分離，幾乎無雜峰產生，且這種衍生化方法制備簡單，能夠有效克服由于糖的異構化而造成的多峰現象，每種糖都能得到單一的色譜峰，有利于進行氣相色譜的定性和定量分析。

圖1 混合標準單糖的糖腈乙酰酯衍生物的氣相色譜圖

如圖2所示，采用糖醇乙酰化法研究混合標準單糖時，糖醇乙酰化衍生物在色譜柱中沒有有效的分離，經過多次實驗，在氣相色譜圖中果糖出現兩個峰，葡萄糖和半乳糖的保留時間重合，在實驗中很難根據標準單糖的色譜峰作定性的對照。

圖2 混合標準單糖的糖醇醋酸鹽衍生法的氣相色譜圖

2.2 南瓜多糖中單糖組成的定性分析結果

本實驗采用糖腈衍生化方法完成了7種單糖（阿拉伯糖、鼠李糖、葡萄糖和半乳糖、果糖、木糖、苷露糖）在毛細管柱中的分離，南瓜多糖中單糖種類的定性采用與標準單糖的色譜保留時間相對照的方法。

2.3 南瓜多糖中單糖組成的定量分析結果

南瓜多糖中各種單糖組成的定量采用糖腈衍生化方法依照1.4.1中所作標準曲線的回歸方程求得，回歸方程和相關系數如表1所示。

表1 標準單糖測定的線性回歸方程和相關系數

由回歸方程求出南瓜皮多糖APP、APP1、APP2中各種單糖的含量、摩爾數及摩爾比如表2所示。采用糖腈衍生化方法測定南瓜皮粗多糖APP由鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖組成，摩爾比為0.3256∶0.1936∶0.3150∶0.3529；用CTAB法得到的APP1由鼠李糖、果糖、葡萄糖和半乳糖組成，摩爾比為0.5934∶0.7194∶0.2612：0.3312；以及 APP2由鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖組成，摩爾比依次為0.3667∶0.1824∶0.1891∶0.3638。實驗結果表明，糖腈衍生化既能確定多糖的組成，也能確定多糖的摩爾比；而糖醇衍生化則不能確定多糖的組成及摩爾比，因此糖腈衍生化為較好方法。

表2 南瓜多糖組分分析結果

2.4 南瓜多糖加樣回收率的測定和精密度實驗

在多糖樣品中定量加入標準單糖，采用糖腈衍生化方法操作后測定回收率，樣品進行了重復（6次）實驗，計算6次平行測定的相對標準偏差（RSD）和回收率，結果見表3。從表中可以看出，用糖腈衍生化方法測定回收率較高，重復性較好，而糖醇衍生化不能準確定量，較糖腈衍生化差。

表3 方法的精密度和回收率（n=6）

3 結論

3.1 制備糖醇乙酸酯衍生物時，果糖經過還原可得到山梨醇和甘露醇的混合物，測定結果容易導致色譜峰的混亂，不易定性分析，并且衍生化方法反應時間較長，操作比較麻煩。

3.2 糖腈乙酸酯衍生物氣相色譜法具有衍生物制備簡便、試劑易得等優點，并且每種單糖都能得到單一的色譜峰。

3.3 采用糖腈衍生化方法對南瓜多糖APP、APP1、APP2中各種單糖的組成進行定性和定量分析，結果表明，采用糖腈衍生化方法可準確地得到南瓜多糖的單糖組成及單糖的含量、摩爾分數以及摩爾比，而糖醇衍生化方法則不能，因此，糖腈衍生化方法是用氣相色譜研究食品多糖的較為合適的衍生化方法。

［1］楊懷謹.多糖研究進展［J］.中國中醫藥信息雜志，2003，9（10）：70-71.

［2］ Schepetkinia， Quinnmt. Botanical， polysacchsrides：macrophage immunomodulation and the therapeutic potentiallntemational［J］.Immunopharmacology，2006（6）：317-333.

［3］Wangjy，Kasperdl，Tzianabos A.Biological chemistry of immunomodulation by zwitterionic polysaceharides［ J］. Carbohydrate Research，2003，338：2531.

［4］陶樂平，丁在富，張部昌.氣相色譜在多糖結構測定中的應用［J］.色譜，1994，5（12）：1-7.

［5］張惟杰.糖復合物生化研究技術［M］.浙江大學出版社，2006：38-40.

Study and comparison of two derivatization methods of polysaccharides by GC

BAI Di-si，ZHANG Jing*
（Department of Food Engineering and Nutrient Science，Shaanxi Normal University，Xi’an 710062，China）

Two methods of derivatization：glyc-nitrile derivatization and furfury alcohol derivatization in gas chromatography（GC）were used to analyze the composition of the polysaccharides，find the linear correlation，calculate the molar ratio and determine recovery of the sample，precision and the repeatability.ln the method of furfury alcohol derivatization，fructose was deoxidized to the mixture of sorbitol and mannitol，and the results could cause the chaos of the chromatographic peaks，made it hard to determine the amounts of the components of the polysaccharides，meanwhile，the reaction of derivatization lasted a long time，manipulation was also troublesome. While using glyc-nitrile derivatization to prepare the derivative，its manipulation was easier，and the reagent was easy to get，every monosaccharide got a single peak.From the study and comparison of the two methods of derivatization，we can see that the method of glyc-nitrile derivatization is the more suitable derivatization method.

polysaccharides；GC；glyc-nitrile derivatization；furfury alcohol derivatization

TS201.2+3

A

1002-0306（2011）02-0322-04

2009-10-12 *通訊聯系人

白娣斯，女，碩士研究生，主要從事天然產物有效成分的化學研究。

國家自然科學基金（10874108）；陜西省自然科學基礎研究計劃（SJ08A16）。