酶法合成咖啡酸葉黃素酯的研究

楊云裳，許建國，張應(yīng)鵬，李春雷

（蘭州理工大學(xué)石油化工學(xué)院，甘肅蘭州730050）

酶法合成咖啡酸葉黃素酯的研究

楊云裳，許建國，張應(yīng)鵬*，李春雷

（蘭州理工大學(xué)石油化工學(xué)院，甘肅蘭州730050）

以葉黃素和咖啡酸為原料，在脂肪酶Novo435的催化下，首次合成了咖啡酸葉黃素酯。研究了脂肪酶催化葉黃素與咖啡酸合成咖啡酸葉黃素酯的影響因素，考察了酶量、溶劑、體系水分、溫度、時間等因素對酯化反應(yīng)的影響。結(jié)果表明，適宜的工藝條件是：酶量10mg/mL，溶劑為氯仿，水含量10mg/g，溫度40℃，反應(yīng)時間24h，在上述條件下咖啡酸轉(zhuǎn)化率可達(dá)88%。采用IR對目標(biāo)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征。

咖啡酸，葉黃素，脂肪酶，酯化反應(yīng)

葉黃素分子中存在共軛雙鍵，共軛雙鍵對氧是極不穩(wěn)定的，特別純的晶體更容易被氧化破壞。許多物理、化學(xué)生物因素都影響葉黃素的穩(wěn)定性，例如氧、光輻射、高溫、酸等［1］。據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)報道［2］，葉黃素在未避光保存條件下60d后其含量僅占原來樣品的45%，而暴露空氣中的葉黃素在60d后其葉黃素質(zhì)量占原來樣品中葉黃素質(zhì)量的9.7%，葉黃素的不穩(wěn)定性限制葉黃素的開發(fā)利用。據(jù)文獻(xiàn)報道，葉黃素酯的生物利用度大于純?nèi)~黃素［3］。本文將葉黃素與咖啡酸合成咖啡酸葉黃素酯，可以大大提高葉黃素的穩(wěn)定性，咖啡酸葉黃素酯在人體內(nèi)水解成葉黃素和咖啡酸，同時滿足人們對咖啡酸的需求。咖啡酸具有廣譜的抑菌作用以及抗病毒、抗蛇毒、抗氧化［4］等藥理作用。傳統(tǒng)化學(xué)方法合成咖啡酸葉黃素酯，反應(yīng)溫度高，不利于葉黃素的穩(wěn)定，而酶催化法具有反應(yīng)條件溫和，產(chǎn)物選擇性高等優(yōu)點(diǎn)。本文以咖啡酸、葉黃素作為底物，考察各因素對于酯化反應(yīng)的影響，并對反應(yīng)條件進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

固定化脂肪酶（Novo435） 諾維信（中國）生物技術(shù)有限公司；咖啡酸、葉黃素、丙酮、乙醇、甲苯、氯仿、正己烷 均為分析純。

硅膠（100～200目） 青島海洋化工有限公司；分子篩（4?） 上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 咖啡酸葉黃素酯的合成 準(zhǔn)確稱取葉黃素56mg（0.1mmol）和咖啡酸36mg（0.2mmol）（摩爾比為1∶2），置于10mL具塞錐形瓶中，加入1.0mL脫水的氯仿，然后加入10mg脂肪酶（Novo435），充入氮?dú)猓?0℃氣浴搖床下，避光振蕩反應(yīng)12h，然后加入15mg活化的4?分子篩，再繼續(xù)反應(yīng)12h停止。

1.2.2 合成反應(yīng)式 見圖1。

圖1 葉黃素與咖啡酸合成咖啡酸葉黃素酯的反應(yīng)式

1.2.3 咖啡酸轉(zhuǎn)化率的計算

式中：AV1：原料酸值；AV2：產(chǎn)物酸值。

2 結(jié)果與討論

2.1 咖啡酸葉黃素酯的紅外（IR）分析

對硅膠柱層析分離純化得到的咖啡酸葉黃素酯作紅外分析，結(jié)果見圖2。3452cm-1處的強(qiáng)吸收峰為咖啡酸上-OH的吸收峰，1739cm-1處的強(qiáng)吸收峰為酯C=O的伸縮振動峰，是酯的特征吸收峰。以上分析說明，咖啡酸和葉黃素在脂肪酶的催化下已經(jīng)發(fā)生酯化反應(yīng)，生成了咖啡酸葉黃素酯。

圖2 咖啡酸葉黃素酯的紅外圖譜

2.2 酶用量對反應(yīng)的影響

在葉黃素加量為20.1mg，葉黃素與咖啡酸摩爾比為1∶2，加入氯仿1.0mL，反應(yīng)溫度為40℃，反應(yīng)時間為24h條件下，考察酶用量對轉(zhuǎn)化率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 酶用量對轉(zhuǎn)化率的影響

由圖3可知，隨著酶量增加，反應(yīng)速度加快，酯化率提高。但酶量達(dá)10mg/mL后，酶量進(jìn)一步增加，酯化率增加緩慢，這是由于過多的酶使反應(yīng)初始生成的副產(chǎn)物水增加，過多的水會使反應(yīng)向負(fù)反應(yīng)進(jìn)行，并且可能導(dǎo)致酶失活［5］，所以酶量為10mg/mL較合適。

2.3 初始加水量對反應(yīng)的影響

水對脂肪酶的影響有兩個方面：一方面，酶需要少量的水以保持活性的三維結(jié)構(gòu)狀態(tài)，水可以保持催化部位的整體性，催化部位的極化、蛋白質(zhì)的穩(wěn)定；另一方面，水含量過高使酶構(gòu)象柔性過大，酶構(gòu)象將向疏水環(huán)境下熱力學(xué)穩(wěn)定的狀態(tài)變化，引起酶結(jié)構(gòu)的改變和失活，同時又限制了疏水性底物在酶分子附近的溶解性。只有最適水量才能使酶表現(xiàn)出最大活力［5］，如圖4所示，加水量為10mg/g比較合適，既保持酶活性的三維結(jié)構(gòu)狀態(tài)，又促進(jìn)反應(yīng)進(jìn)行。

2.4 有機(jī)溶劑對反應(yīng)的影響

在使用不同的酶或者在不同的反應(yīng)體系中，最適于使用的有機(jī)溶劑也是不同的。有機(jī)溶劑影響酶催化的途徑有三種：一是有機(jī)溶劑與酶直接發(fā)生作用，通過干擾氫鍵和疏水鍵等改變酶的構(gòu)象，從而導(dǎo)致酶的活性被抑制或酶的失活；二是有機(jī)溶劑和能擴(kuò)散的底物或產(chǎn)物相互作用，影響正常酶催化反應(yīng)的進(jìn)行；三是有機(jī)溶劑還可以直接和酶所需的必需水相互作用。一般認(rèn)為在非水介質(zhì)中添加親水性或和水互溶性的有機(jī)溶劑對反應(yīng)不利，因為它們會奪取酶周圍微環(huán)境的必需水，從而使酶失活，所以選擇的有機(jī)溶劑疏水性越強(qiáng)越好［6］。如圖5所示，氯仿比較合適。

圖4 初始加水量對轉(zhuǎn)化率的影響

圖5 有機(jī)溶劑對轉(zhuǎn)化率的影響

2.5 反應(yīng)溫度對反應(yīng)的影響

固定化酶Novozyme435在100℃仍保持較高的酶活。為此在其它條件不變的情況下，只改變反應(yīng)溫度，觀察其對轉(zhuǎn)化率的影響，結(jié)果見圖6。隨溫度的升高，轉(zhuǎn)化率增加，但溫度過高（＞60℃）對葉黃素的穩(wěn)定不利［2，8］，實(shí)驗表明在40℃比較合適。

圖6 反應(yīng)溫度對轉(zhuǎn)化率的影響

2.6 反應(yīng)時間對酯化反應(yīng)的影響

反應(yīng)時間對酯化反應(yīng)的影響見圖7，可看出反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率隨著反應(yīng)時間的延長而提高，但30h后轉(zhuǎn)化率的增長趨勢不明顯，可能由于反應(yīng)時間過長，酶的機(jī)械損耗越大，活力喪失，影響酯化反應(yīng)進(jìn)行［9］。所以總體時間控制在24h即可。

圖7 反應(yīng)時間對轉(zhuǎn)化率的影響

3 結(jié)論

本文通過酯化反應(yīng)，利用固定化脂肪酶催化葉黃素與咖啡酸合成咖啡酸葉黃素酯，并對影響此反應(yīng)的各種因素進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。反應(yīng)經(jīng)初步優(yōu)化得到的條件為：酶量10mg/mL，溶劑為氯仿，水含量10mg/g，溫度40℃，反應(yīng)時間24h，在上述條件下咖啡酸轉(zhuǎn)化率可達(dá)88%。

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Lipase-catalyzed synthesis of caffeic acid lutein ester

YANG Yun-shang，XU Jian-guo，ZHANG Ying-peng*，LI Chun-lei
（School of Petrochemical Engineering，Lanzhou University of Technology，Lanzhou 730050，China）

The caffeic acid lutein ester was first synthesized by lutein and caffeic acid under lipase condtion.The effects of enzyme concentration，solvent，the ratio of water to substrates，reaction temperature and reaction time on the esterification were investigated.lt was showed that the optimized conditions were：enzyme concentration 10mg/mL，the ratio of water to substrates 10mg/g，solvent was chloroform，reaction temperature 40℃，reaction time 24h.The conversion rate was up to 88%when the esterification was carried on under the optimal conditions.The product stucture was analyzed by lR analysis.

caffeic acid；lutein；lipase；esterification

TS202.3

A

1002-0306（2011）02-0283-03

2009-12-28 *通訊聯(lián)系人

楊云裳（1972-），女，博士，副教授，研究方向：生物有機(jī)化學(xué)。