黃參粗多糖脫蛋白工藝以及對(duì)亞硝酸鹽清除作用的研究

郭小鵬，田呈瑞，*，高春燕，孟友武

（1.陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西西安710062；2.甘肅省山丹軍馬場(chǎng)食品公司，甘肅張掖734104）

黃參粗多糖脫蛋白工藝以及對(duì)亞硝酸鹽清除作用的研究

郭小鵬1，田呈瑞1，*，高春燕1，孟友武2

（1.陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西西安710062；2.甘肅省山丹軍馬場(chǎng)食品公司，甘肅張掖734104）

采用Sevag法、TCA-Sevag法、木瓜蛋白酶-Sevag法對(duì)黃參粗多糖脫蛋白工藝進(jìn)行了研究。另外，研究了體外模擬胃液條件下黃參多糖對(duì)亞硝酸鹽的清除作用，采用分光光度法測(cè)定了黃參粗多糖對(duì)亞硝酸鹽的清除率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，通過(guò)比較三種脫蛋白方法，木瓜蛋白酶-Sevag法較好，累計(jì)蛋白去除率可達(dá)68.65%，累計(jì)多糖損失率17.14%。黃參多糖對(duì)亞硝酸鹽清除最佳方法為：向25mL模擬胃液中加入50mg黃參多糖，反應(yīng)時(shí)間為15min，對(duì)亞硝酸鹽的清除率最高，可達(dá)86.6%。

黃參，脫蛋白，亞硝酸鹽，清除

黃參是傘形科迷果芹屬的迷果芹（Sphallerocarpus gracilis）的肉質(zhì)直根，主要分布于大黃山、祁連山草原地帶，海拔高度2400～2900m。黃參是山丹縣高寒陰濕地區(qū)生長(zhǎng)的一種二年生野生草本植物，其肉質(zhì)直根富含人體必需的多種氨基酸、礦物質(zhì)和微量元素，是一種純天然保健食品［1-2］。黃參具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值，是一種理想的保健食品，且具有祛風(fēng)、勝濕、止痛等功效，對(duì)治療晚期癌、誘導(dǎo)癌細(xì)胞調(diào)節(jié)作用顯著［3］。目前黃參多糖的提取多采用水提醇沉的方法，得到的粗多糖中含有大量的雜質(zhì)如蛋白質(zhì)、鞣質(zhì)、色素等。黃參蛋白質(zhì)含量較高，所提多糖中蛋白質(zhì)含量也較高，分離純化多糖過(guò)程中，脫蛋白是非常關(guān)鍵的一步，目前常用去除蛋白質(zhì)類成分的主要方法有Sevag法、TCA-Sevag和木瓜蛋白酶-Sevag法。本文采用上述三種方法脫除黃參多糖中的游離蛋白，通過(guò)測(cè)定前后蛋白質(zhì)成分和多糖含量的變化，比較三種脫蛋白方法的優(yōu)缺點(diǎn)，以確定黃參多糖脫蛋白最佳工藝，為黃參多糖的分離純化提供理論基礎(chǔ)。同時(shí)在體外模擬胃液條件下，研究黃參多糖清除亞硝酸鹽的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃參 2009年10月15日采自甘肅山丹軍馬場(chǎng)；考馬斯亮藍(lán)G25、牛血清蛋白、苯酚、濃硫酸、葡萄糖、石油醚、無(wú)水乙醇、鹽酸、對(duì)氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、亞硝酸鈉 均為分析純；模擬胃液［4］稱取2.0g NaCl，加雙蒸水溶解，移入1000mL容量瓶，加入7mL濃鹽酸，雙蒸水定容至刻度。

TU-1800/1800S型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京譜析通用儀器廠；722型分光光度計(jì) 上海市精密科技儀器有限公司；LG微波爐、LXJ-IIB型離心機(jī)、RE-52旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器 上海安亭實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；高速粉碎機(jī) 浙江省上虞市大亨橋化驗(yàn)儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黃參粗多糖的提取工藝 黃參粉（60℃干燥，過(guò)20目篩）→脫脂（石油醚，2h）→水溶脹→微波提取→離心（4000r/min）→取上清液→3倍 95%乙醇醇沉→離心（4000r/min）→取沉淀→真空干燥→黃參粗多糖

1.2.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作和蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作參考文獻(xiàn)［5］，蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線制作參考文獻(xiàn)［6］。

1.2.3 操作要點(diǎn)

1.2.3.1 黃參粗多糖脫蛋白工藝研究 Sevag法：取10mL已知濃度的粗多糖溶液，將提取液與有機(jī)溶劑（氯仿與正丁醇體積比5∶1混合，用振蕩器劇烈振蕩20min，4000r/min離心20min，除去沉淀。從除去蛋白質(zhì)的多糖溶液中，取出1mL進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)法測(cè)蛋白質(zhì)含量，再取出5mL加入50mL容量瓶中定容，然后用苯酚硫酸法測(cè)出多糖含量。使用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其累計(jì)蛋白質(zhì)去除率及累計(jì)多糖損失率。

TCA-Sevag法：先在一定濃度多糖溶液中加入一定體積三氯乙酸，使其終濃度為4%，混勻后于4℃冰箱靜置過(guò)夜，次日4500r/min離心20min，取上清液，再采用上述Sevag法脫蛋白，計(jì)算其累計(jì)蛋白質(zhì)去除率及累計(jì)多糖損失率。

木瓜蛋白酶-Sevag法：加入0.1%的木瓜蛋白酶（w/v）在pH6.4條件下，于60℃酶解3.5h，再采用上述Sevag法脫蛋白，計(jì)算其累計(jì)蛋白質(zhì)去除率及累計(jì)多糖損失率。

1.2.3.2 黃參多糖對(duì)亞硝酸鹽清除作用的研究 各稱取一定質(zhì)量的黃參多糖放于50mL容量瓶中，加入25mL模擬胃液，用超聲增溶，37℃預(yù)熱10min，加入5μg/mL的亞硝酸鈉溶液2mL，然后把混合物置于37℃水浴鍋中避光反應(yīng)一定時(shí)間；加入0.4%對(duì)氨基苯磺酸2mL，搖勻靜置5min；再加入0.2%鹽酸萘基乙二胺顯色劑1mL，搖勻加水定容，靜置15min后以蒸餾水作空白測(cè)各溶液的吸光度，計(jì)算黃參多糖對(duì)NO-2的清除率。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

由1.2.2方法可得，y=6.8232x+0.0083，R2= 0.9982，其中：y為吸光值，x為葡萄糖量。

2.2 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線

由1.2.2方法可得，y=0.0065x+0.0675，R2= 0.999，其中：y為吸光值，x為蛋白質(zhì)量。

2.3 最大吸收波長(zhǎng)的確定

吸取5.0μg/mL NaNO2標(biāo)準(zhǔn)溶液1mL置于10mL具塞試管中，加入2mL 0.4%對(duì)氨基苯磺酸，搖勻，放置5min，加入1mL 0.2%鹽酸萘乙二胺顯色，放置15min，于1cm比色杯中，另以蒸餾水代替亞硝酸鈉，用同樣方法配制的溶液作為空白，作光譜掃描，測(cè)定最大吸收波長(zhǎng)為548nm處。

2.4 Sevag法［7］脫蛋白分析

Sevag法脫蛋白，計(jì)算其累計(jì)蛋白質(zhì)去除率及累計(jì)多糖損失率，見(jiàn)表1。

表1 Sevag法洗脫蛋白前后蛋白質(zhì)及多糖的變化

2.5 TCA-Sevag法［8］脫蛋白分析

TCA-Sevag法脫蛋白，計(jì)算其累計(jì)蛋白質(zhì)去除率及多糖損失率，見(jiàn)表2。

表2 TCA-Sevag法洗脫蛋白前后蛋白質(zhì)及多糖的變化

2.6 木瓜蛋白酶-Sevag法［9］脫蛋白分析

木瓜蛋白酶-Sevag法脫蛋白，計(jì)算其累計(jì)蛋白質(zhì)去除率及多糖損失率，見(jiàn)表3。

表3 木瓜蛋白酶-Sevag法洗脫蛋白前后蛋白質(zhì)及多糖的變化

2.7 黃參多糖對(duì)亞硝酸鹽清除率的影響

2.7.1 反應(yīng)時(shí)間對(duì)亞硝酸鹽清除率的影響 向25mL模擬胃液體系中加入5.0mg黃參多糖，按1.2.3.2操作，分別反應(yīng)不同的時(shí)間，計(jì)算清除率，反應(yīng)時(shí)間對(duì)亞硝酸鹽清除率的影響，見(jiàn)表4。

由表4可知，當(dāng)反應(yīng)在15min最佳清除率時(shí)間達(dá)到最大。

2.7.2 黃參粗多糖用量對(duì)亞硝酸鹽清除率的影響向25mL模擬胃液體系中加入不同量的黃參多糖，反應(yīng)15min，按1.2.3.2操作，計(jì)算清除率，黃參粗多糖用量對(duì)亞硝酸鹽清除率的影響，見(jiàn)表5。

由表5可知，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為15min，黃參多糖用量為50mg時(shí)，亞硝酸鹽的清除率最高，可達(dá)86.6%。

3 討論

3.1 實(shí)驗(yàn)表明用Sevag法脫蛋白6次后，蛋白質(zhì)的含量已經(jīng)變化不大，Sevag法處理6次后，蛋白質(zhì)總?cè)コ蕛H為35.63%，多糖損失率為74.62%，多糖損失率較高，可能由于多糖中的蛋白大多數(shù)以糖蛋白的形式結(jié)合，導(dǎo)致脫蛋白的同時(shí)，多糖大量的損失，而且脫蛋白效果極不理想，操作繁瑣，重復(fù)次數(shù)較多，能耗和時(shí)耗都很高。用TCA-Sevag法脫蛋白，經(jīng)TCA處理后蛋白脫除率達(dá)到85.44%，多糖損失率為54.12%，可見(jiàn)脫蛋白效果較理想，但是多糖損失率也較高。用木瓜蛋白酶-Sevag法脫蛋白時(shí)，木瓜蛋白酶處理后，再經(jīng)過(guò)3次Sevag法處理后，蛋白質(zhì)的脫除率達(dá)到68.65%，多糖損失率僅為17.14%，多糖損失較少，酶將糖蛋白水解分離，故在Sevag處理時(shí)，多糖損失較少。使用木瓜蛋白酶-Sevag法脫蛋白，其蛋白脫除率比單獨(dú)用Sevag法高33.02%，雖然沒(méi)有TCA-Sevag法脫蛋白高，但是多糖損失率比TCASevag低36.98%，故采用木瓜蛋白酶-Sevag法脫蛋白效果較優(yōu)。

3.2 據(jù)報(bào)道，黃酮類、多糖、色素都具有清除亞硝酸鹽的作用［10］。本實(shí)驗(yàn)表明，在體外模擬胃液實(shí)驗(yàn)中，黃參多糖對(duì)亞硝酸鹽有清除作用，其最佳方法為：25mL模擬胃液加入黃參多糖50mg，反應(yīng)時(shí)間為15min，黃參多糖對(duì)亞硝酸鹽的清除率最高，可達(dá)86.6%。

表4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)亞硝酸鹽清除率的影響

表5 黃參粗多糖用量對(duì)亞硝酸鹽清除率的影響

［1］張定君，鄒卿，唐謙.黃參的生物學(xué)特性與栽培技術(shù)研究初報(bào)［J］.甘肅農(nóng)業(yè)科技，2000（7）：44-45.

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［4］Board of Trustees.The united states pharmacopeia［M］.1995：2053.

［5］倪受東，嚴(yán)德江，徐先祥.大黃多糖的提取及含量測(cè)［J］.中國(guó)藥業(yè)，2007，16（13）：10-11.

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Study on removal process of proteins from crude Sphallerocarpus gracilis polysaccharides and its scavenging capability to nitrite

GUO Xiao-peng1，TIAN Cheng-rui1，*，GAO Chun-yan1，MENG You-wu2
（1.College of Food Engineering and Nutrition Science，Shaanxi Normal University，Xi’an 710062，China；2.Food Limited Liability Company of Shandan Jun Ma Chang，Zhangye 734104，China）

Sevag method，TCA-Sevag and Papain-Sevag method of removing protein process from crude S.gracilis polysaccharides were studied.ln addition，under the condition of simulated gastric juice in vitro，the effect of S.gracilis polysaccharide to scavenge nitrite was studied，using spectrophotometric to determine the parameters of the S.gracilis polysaccharide on clearance rate of nitrite.Experimental results showed that the method of removal of protein by comparing the three kinds of excellent，Papain-Sevag method was better，the accumulated protein in the removal rate was up to 68.65%，the cumulative loss rate of polysaccharide was 17.14%.S.gracilis polysaccharide on the best method for scavenging nitrite：adding 50mg S.gracilis polysaccharide to the 25mL simulated gastric juice，reaction time was 15min，the scavenging rate reached the maximum 86.6%.

Sphallerocarpus gracili；deproteinized；nitrite；scavenging

TS201.2+3

B

1002-0306（2011）02-0274-03

2010-03-31 *通訊聯(lián)系人

郭小鵬（1986-），男，碩士研究生，從事食品新資源開發(fā)研究。