超聲輔助提取功勞木中鹽酸小檗堿工藝研究

白靖文，葉 非

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030）

超聲輔助提取功勞木中鹽酸小檗堿工藝研究

白靖文，葉 非*

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030）

為了優(yōu)化功勞木中鹽酸小檗堿的超聲波輔助提取工藝，采用單因子實(shí)驗(yàn)和L9（34）正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，研究了超聲時(shí)間、超聲功率、乙醇濃度、提取溫度、液料比、篩分目數(shù)對(duì)功勞木中鹽酸小檗堿提取的影響。結(jié)果表明，影響鹽酸小檗堿得率的主次因素為乙醇濃度，液料比，超聲時(shí)間，超聲功率；經(jīng)正交實(shí)驗(yàn)確定功勞木鹽酸小檗堿最佳提取工藝條件為：乙醇濃度80%，超聲提取時(shí)間為30min，超聲功率選擇為500W，液料比為9，經(jīng)5次平行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，該實(shí)驗(yàn)工藝穩(wěn)定可靠，與對(duì)照實(shí)驗(yàn)相比，鹽酸小檗堿得率可提高56.1%。

超聲輔助提取，功勞木，鹽酸小檗堿

功勞木為小檗科植物闊葉十大功勞或細(xì)葉十大功勞的干燥莖［1］，多分布于廣西、云南及浙江等地。為常用的傳統(tǒng)中藥，具有清熱燥濕、瀉火除蒸、解毒療瘡之功效［2］。功勞木中含小檗堿、尖刺堿、異漢防己堿、小檗胺、藥根堿等多種生物堿［3-4］，其中鹽酸小檗堿為功勞木中的主要的藥物活性成分，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明鹽酸小檗堿具有抗病原微生物、抗?jié)?、降壓、抗心律失常、降血糖、抗炎與免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等多種作用［4-5］，同時(shí)發(fā)現(xiàn)功勞木還具有殺蟲、抑菌的生物活性［6-7］，因此對(duì)其提取工藝進(jìn)一步研究，具有重要意義。超聲輔助提?。╱ltrasound-assisted extraction，UAE）是利用超聲波的強(qiáng)振動(dòng)、高加速度、強(qiáng)空化效應(yīng)、強(qiáng)攪拌作用來縮短藥物有效成分進(jìn)入溶劑的時(shí)間，加快提取過程，提高提取率，并有效避免高溫對(duì)有效成分的破壞［8-9］。近年來，UAE在生物堿［10］、黃酮［11］、皂苷［12］、酚類［13］等天然產(chǎn)物提取中取得了良好的效果，在功勞木中應(yīng)用UAE提取鹽酸小檗堿國(guó)內(nèi)外還未見報(bào)道。為此，本研究選取超聲時(shí)間、超聲功率、乙醇濃度、提取溫度、液料比、篩分目數(shù)等因素，在單因子實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用L9（34）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，進(jìn)行4因素3水平正交實(shí)驗(yàn)，對(duì)功勞木鹽酸小檗堿的提取工藝進(jìn)行研究，以期為功勞木的精深加工與功勞木鹽酸小檗堿植物源農(nóng)藥研究和應(yīng)用提供依據(jù)［14-15］。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

功勞木 購(gòu)自哈爾濱市三棵藥材市場(chǎng)，依據(jù)藥典所載方法鑒定為十大功勞的干燥莖；鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品 購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

JY92-2D超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；TU-1901雙光速紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 鹽酸小檗堿提取 準(zhǔn)確稱取過200目篩的功勞木粉2g于燒杯中，浸泡12h，按設(shè)定的時(shí)間、功率、溫度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，抽濾，濾液3000r·min-1離心，上清液過濾，濾液蒸干，殘?jiān)鼫?zhǔn)確加入5mL無水乙醇溶解，準(zhǔn)確吸取0.5mL定容于25mL的容量瓶中，在鹽酸小檗堿的最大吸收波長(zhǎng)（345nm）下測(cè)定吸光度。對(duì)照實(shí)驗(yàn)的操作及條件除未采用超聲波外，其余和超聲提取最佳條件相同。

1.2.2 鹽酸小檗堿得率測(cè)定

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 準(zhǔn)確稱取0.05g鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品，用無水乙醇定容至25mL容量瓶中，配成標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別量取標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20和1.60mL，分別注入一組25mL容量瓶中，稀釋至刻度，在延胡索乙素的最大波長(zhǎng)（345nm）下，以第一瓶做空白，分別測(cè)定吸光度，以測(cè)定得到的吸光度為縱坐標(biāo)（A），以延胡索乙素的濃度（C）為橫坐標(biāo)得回歸方程A=0.063C+0.044，R2= 0.9985。鹽酸小檗堿濃度在0.016～0.128mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.2.2.2 得率測(cè)定 吸取1.2.1中提取液注入1cm的比色皿，在波長(zhǎng)345nm處測(cè)定鹽酸小檗堿含量。重復(fù)3次，取平均值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求出提取物中鹽酸小檗堿的含量，按下面方法計(jì)算鹽酸小檗堿得率。

鹽酸小檗堿得率（%）=鹽酸小檗堿質(zhì)量/功勞木質(zhì)量×100%

1.2.3 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液0.50mL定容于25mL容量瓶中，依1.2.2項(xiàng)方法測(cè)定吸光度，平行操作6次，結(jié)果RSD%為0.59%（n= 6）。

1.2.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確吸取鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2mL，按1.2.2項(xiàng)測(cè)定方法處理，分別在0、0.5、1、1.5、2、2.5、3h測(cè)定吸光度，結(jié)果 RSD為 0.89%（n=6）。

1.2.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取已知含量的樣品6份，分別加入延胡索乙素對(duì)照品溶液，按1.2.2項(xiàng)方法處理，測(cè)定吸光度，計(jì)算鹽酸小檗堿含量，回收率為別為99.17%、97.65%、99.19%、98.36%、100.07%、100.1%，平均回收率為99.09%，RSD為0.97%（n=6）。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 乙醇濃度對(duì)鹽酸小檗堿得率的影響 準(zhǔn)確稱取2g過200目篩的功勞木粉6份，分別加入濃度為40%、50%、60%、70%、80%、100%的乙醇溶液22mL，在超聲功率為500W，提取溫度為40℃條件下超聲提取20min，測(cè)定鹽酸小檗堿得率，研究不同乙醇濃度對(duì)實(shí)驗(yàn)得率的影響，結(jié)果見圖1。隨著乙醇濃度的增大，鹽酸小檗堿的得率先增大后減小，這是因?yàn)辂}酸小檗堿為弱極性物質(zhì)，隨著乙醇濃度的增大，溶劑的極性減小，當(dāng)乙醇濃度為70%時(shí)，溶劑的極性與鹽酸小檗堿極性相當(dāng)，得率最高。之后隨著乙醇濃度的增大，溶劑極性繼續(xù)減小，此時(shí)溶劑與鹽酸小檗堿的極性相差較大，不適合提取。因此實(shí)驗(yàn)選取乙醇濃度為70%最佳。

2.1.2 超聲時(shí)間對(duì)鹽酸小檗堿得率的影響 準(zhǔn)確稱取2g過200目篩的功勞木粉6份，加入濃度為70%的乙醇溶液22mL，在超聲功率為500W，提取溫度為40℃條件下，分別超聲提?。?0、15、20、25、30、35min，測(cè)定鹽酸小檗堿得率，研究不同提取時(shí)間對(duì)實(shí)驗(yàn)得率的影響，結(jié)果見圖2。延長(zhǎng)超聲輔助處理時(shí)間會(huì)提高鹽酸小檗堿提取效果，但當(dāng)處理時(shí)間達(dá)25min以上時(shí)，提取效果提高不顯著，35min時(shí)還略有下降。這是因?yàn)槌曁幚頃r(shí)間的延長(zhǎng)，提取出的雜質(zhì)含量相對(duì)增加，降低了鹽酸小檗堿在提取溶液中的溶解度，同時(shí)還會(huì)被分解、破壞，導(dǎo)致其得率下降。因此實(shí)驗(yàn)選取超聲輔助處理時(shí)間為25min為最佳。

圖1 乙醇濃度對(duì)鹽酸小檗堿得率的影響

圖2 超聲提取時(shí)間對(duì)鹽酸小檗堿得率的影響

2.1.3 液料比對(duì)鹽酸小檗堿得率的影響 準(zhǔn)確稱取2g過200目篩的功勞木粉6份，分別加入濃度為70%的乙醇溶液14、18、22、26、30、34mL，在超聲功率為500W，提取溫度為40℃條件下，超聲提取25min，測(cè)定鹽酸小檗堿得率，研究不同液料比對(duì)實(shí)驗(yàn)得率的影響，結(jié)果見圖3。液料比低于15時(shí)，鹽酸小檗堿得率隨液料比增加而增加，達(dá)到17時(shí)甚至開始下降，而液料比從13增加為15時(shí)，鹽酸小檗堿得率增加并不顯著，因此從節(jié)省溶劑角度選擇液料比為13。

圖3 液料比對(duì)鹽酸小檗堿得率的影響

2.1.4 提取溫度對(duì)鹽酸小檗堿得率的影響 準(zhǔn)確稱取2g過200目篩的功勞木粉5份，加入濃度為70%的乙醇溶液26mL，在超聲功率為500W，提取溫度分別為：30、40、50、60、70℃條件下，超聲提取25min，測(cè)定鹽酸小檗堿得率，研究不同提取溫度對(duì)實(shí)驗(yàn)得率的影響，結(jié)果見圖4。隨溫度升高鹽酸小檗堿得率緩慢增高，60℃時(shí)達(dá)到最高，70℃時(shí)開始下降。但不同溫度的鹽酸小檗堿得率差別不顯著，這說明超聲波提取時(shí)溫度不是影響提取效果的主要因素，這也正是超聲波提取的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)。為減少能耗，實(shí)驗(yàn)選擇溫度為50℃。

圖4 超聲提取溫度對(duì)鹽酸小檗堿得率的影響

2.1.5 超聲功率對(duì)鹽酸小檗堿得率的影響 準(zhǔn)確稱取2g過200目篩的功勞木粉7份，加入濃度為70%的乙醇溶液26mL，在提取溫度為50℃，超聲功率分別為：200、250、300、350、400、450、500W條件下，超聲提取25min，測(cè)定鹽酸小檗堿得率，研究不同超聲功率對(duì)實(shí)驗(yàn)得率的影響，結(jié)果見圖5。隨著超聲功率的增加鹽酸小檗堿得率升高而后又開始下降，這是由于功率較小時(shí)，并不能使細(xì)胞壁破碎鹽酸小檗堿得以溶出，功率達(dá)到400W，鹽酸小檗堿得率最高，功率再升高，破碎細(xì)胞壁的同時(shí)也能破壞鹽酸小檗堿的分子結(jié)構(gòu)，一部分雜質(zhì)也一起溶出，降低了鹽酸小檗堿的得率，因此超聲功率選擇400W為最佳。

圖5 超聲功率對(duì)鹽酸小檗堿得率的影響

2.1.6 篩分目數(shù)對(duì)鹽酸小檗堿得率的影響 準(zhǔn)確稱取2g分別過100、150、200、250、300、400目篩的功勞木粉6份，加入濃度為70%的乙醇溶液26mL，在超聲功率為400W，提取溫度為50℃條件下，超聲提取25min，測(cè)定鹽酸小檗堿得率，研究不同篩分目數(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)得率的影響，結(jié)果見圖6。篩分目數(shù)越高，功勞木顆粒越細(xì)，物料與溶劑的接觸面積越大，鹽酸小檗堿得率越高，但是這種變化趨勢(shì)在250目之后并不顯著，因此篩分目數(shù)選擇250目。

圖6 篩分目數(shù)對(duì)鹽酸小檗堿得率的影響

2.2 正交實(shí)驗(yàn)

從單因素實(shí)驗(yàn)可以看出提取溫度和篩分目數(shù)不是影響功勞木中鹽酸小檗堿得率的主要因素，因此，以功勞木中鹽酸小檗堿得率為指標(biāo)，選取了乙醇濃度、超聲時(shí)間、超聲功率、液料比4個(gè)因素，設(shè)計(jì)L9（34）正交實(shí)驗(yàn)，正交實(shí)驗(yàn)方案見表1，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2和表3。由表2極差分析可知RA＞RD＞RB＞RC，各因素影響大小順序是A＞D＞B＞C，即乙醇濃度＞液料比＞超聲時(shí)間＞超聲功率，由于實(shí)驗(yàn)所確定的功勞木中鹽酸小檗堿最佳提取工藝A3B2C3D1沒有出現(xiàn)在正交表中，經(jīng)過驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在上述最佳提取工藝條件下鹽酸小檗堿得率為1.32%高于1.29%。所以確定最佳提取工藝條件為A3B2C3D1，即乙醇濃度為80%，超聲提取時(shí)間為30min，超聲功率選擇為500W，液料比為9。由表3方差分析結(jié)果可知，相對(duì)于誤差來源的C，A、D對(duì)鹽酸小檗堿得率影響顯著（P＜0.05），B因素的影響不顯著（P＞0.05）。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

表2 L9（34）正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 方差分析表

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

在上述優(yōu)化條件下，進(jìn)行5次平行實(shí)驗(yàn)，得到的結(jié)果如下：鹽酸小檗堿得率分別是1.34%、1.31%、1.32%、1.33%和1.31%，得率平均值1.322%，RSD為0.99%。表明所選的最優(yōu)工藝條件是適當(dāng)?shù)?，?shí)驗(yàn)條件下所得工藝參數(shù)可靠。

相同提取時(shí)間下，對(duì)照實(shí)驗(yàn)中鹽酸小檗堿得率為0.847%。與對(duì)照實(shí)驗(yàn)得率相比，超聲波輔助提取工藝將得率提高了56.1%。

3 結(jié)論

3.1 以鹽酸小檗堿得率為指標(biāo)，獲得了鹽酸小檗堿提取的最佳工藝條件：乙醇濃度為80%，超聲提取時(shí)間為30min，超聲功率選擇為500W，液料比為9，經(jīng)5次平行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，該實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定可靠。

3.2 在最優(yōu)工藝條件下，與對(duì)照實(shí)驗(yàn)比較，鹽酸小檗堿得率可提高56.1%，具有很好的應(yīng)用前景。

3.3 所研究的實(shí)驗(yàn)因素對(duì)功勞木中鹽酸小檗堿得率的影響次序?yàn)橐掖紳舛?，液料比，超聲時(shí)間，超聲功率。

［1］應(yīng)俊生.中國(guó)植物志（第29卷）［M］.北京：科學(xué)出版社，2001：223-224.

［2］王筠默.中藥十大功勞的研究［J］.中醫(yī)藥研究，2002，18（5）：45.

［3］孫文基，繩金房.天然活性成分簡(jiǎn)明手冊(cè)［M］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，1996：327-328.

［4］崔學(xué)軍.小檗堿的藥理學(xué)研究進(jìn)展及臨床新用途［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2006，17（7）：1311-1312.

［5］王浴生，鄧文龍，薛春生.中藥藥理與應(yīng)用［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2002：1024-1026.

［6］陳新華，鄧業(yè)成，朱燕紅.46種植物提取物對(duì)柑橘紅蜘蛛的殺螨活性［J］.廣西師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2006，24（1）：95-97.

［7］周利娟，黃繼光，徐漢虹，等.幾種植物的殺蟲活性初探［J］.農(nóng)藥，2006，45（5）：347-349.

［8］劉小平.中藥分離工程［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：155-156.

［9］黃可龍.超聲場(chǎng)強(qiáng)化中藥有效成分提取動(dòng)力學(xué)模型［J］.化工學(xué)報(bào)，2004，55（4）：646-648.

［10］盛桂華，周泉城.超聲波輔助提取山豆根氧化苦參堿研究［J］.農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2008，24（3）：291-294.

［11］Wen Huang，An Xue，Hai Niu，et al.Optimised ultrasonicassisted extraction of flavonoids from Folium eucommiae and evaluation of antioxidant activity in multi-test systems in vitro［J］.Food Chemistry，2009，114（3）：1147-1154.

［12］ FangChen，YangzhaoSun，GuanghuaZhao，etal. Optimization of ultrasound-assisted extraction of anthocyanins in red raspberries and identification of anthocyanins in extract using high-performance liquid chromatography-mass spectrometry［J］. Ultrasonics Sonochemistry，2007，14（6）：767-778.

［13］Fabiano A N，F(xiàn)ernandes，F(xiàn)rancisco E，et al.Optimization of ultrasound extraction of phenolic compounds from coconut（Cocos nucifera）shell powder by response surface methodology［J］. Ultrasonics Sonochemistry，2008，15（1）：95-100.

［14］曾祥英，勞邦盛，董玉蓮，等.十大功勞中異漢防己堿的提取與分析［J］.分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2003，22（6）：89-91.

［15］邢俊波，吳禾，劉云，等.正交設(shè)計(jì)優(yōu)選功勞木中鹽酸小檗堿提取工藝［J］.中醫(yī)藥學(xué)刊，2005，23（10）：1829-1830.

Ultrasonic-assisted extraction of berberine from Caulis Mahonia

BAI Jing-wen，YE Fei*
（College of Science of Northeast Agriculture University，Harbin 150030，China）

For optimal parameters of extraction condition for berberine of Caulis Mahonia，effects of ultrasonic extraction time，ultrasonic extraction temperature on berberine yield were studied through single factor experiments and orthogonal experiments.The results indicated that the effect sequence of four main factors for berberine yield were as follows：ethanol concentration，liquid-to-solid ratio，ultrasonic extraction time，ultrasonic power.The optimal extraction conditions were as follows：80%ethanol as the solvent，ultrasonic extraction time 30min，ultrasonic power 500W，liquid-to-solid ratio 9.With the verification of five parallel tests，the test process was stable and reliable. Comparing with control experiment，berberine yield in extract increased by 56.1%.

ultrasonic-assisted extraction（UAE）；Caulis Mahonia；berberine

TS201.1

B

1002-0306（2011）02-0245-04

2010-01-25 *通訊聯(lián)系人

白靖文（1978-），男，在讀博士，講師，研究方向：植物源天然藥物提取及測(cè)定。

哈爾濱青年科技創(chuàng)新人才基金項(xiàng)目（2009RFQXN099）。