乳酸桿菌脈沖場凝膠電泳分子分型的條件優化

許飛利，楊曉光，郭云昌，付 萍，王洪新，李志剛，劉秀梅，*

（1.江南大學食品學院，江蘇無錫214122；2.中國疾病預防控制中心營養與食品安全所，北京100021）

乳酸桿菌脈沖場凝膠電泳分子分型的條件優化

許飛利1，楊曉光2，郭云昌2，付 萍2，王洪新1，李志剛2，劉秀梅2，*

（1.江南大學食品學院，江蘇無錫214122；2.中國疾病預防控制中心營養與食品安全所，北京100021）

目的：通過將脈沖場凝膠電泳（PFGE）方法應用于乳酸桿菌分型研究，以建立乳酸桿菌PFGE分型的最優方法。方法：針對不同內切酶、酶切濃度、酶切時間、脈沖時間等影響PFGE分型結果的重要因素進行優化，使用優化后的條件對乳酸桿菌22株標準菌株進行分型研究。結果：在乳酸桿菌的PFGE分型研究中，選擇AscI為內切酶、酶切濃度為30U/150μL、酶切時間為4.5h、脈沖時間為1～15s為PFGE電泳的最優條件，在所分析的22株乳酸桿菌標準菌株中，5種乳酸桿菌的PFGE圖譜各不相同，但種內不同株電泳圖譜的區別并不穩定。結論：PFGE方法可用于乳酸桿菌的基因分型研究。

脈沖場凝膠電泳（PFGE），乳酸桿菌，分子分型

乳酸桿菌是人及動物腸道中重要的益生菌，在維持和調節人體內微生態平衡、抑制病原微生物侵襲、防止多種疾病等方面具有舉足輕重的作用［1］，在食品工業和醫藥行業中應用廣泛，主要有嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、副干酪乳桿菌、植物乳桿菌、發酵乳桿菌等。近年來隨著分子生物學的發展，有關乳酸桿菌分子生物學方面的研究也越來越受到科學研究者的關注。本實驗將細菌分子分型的標準—脈沖場凝膠電泳方法（pulse field gel electrophoresis， PFGE）用于乳酸桿菌的分型研究中，對影響實驗結果的相關因素進行了優化分析，初步確定乳酸桿菌PFGE合適的分型條件。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實驗用乳酸桿菌標準菌株及沙門菌Braenderup參考菌株H9812 均由中國疾病預防控制中心營養與食品安全所食源性疾病監控室提供，所有實驗菌株實驗前均經過API50CHL生化板鑒定；MRS瓊脂、MRS肉湯 OXOID公司；ApaI、SmaI、AscI、XbaI限制性內切酶 NewEngland公司；Tris base、Tris-HCl Promega公司；蛋白酶K Merck公司；SeaKem Gold瓊脂糖 Cambrex公司；溶菌酶、SLS（Sodium lauroyl Sarcosine）、SDS（Sodium dodecyl sulfate）、Na2EDTA· 2H2O 均購自美國Sigma公司。

比濁管，bioMérieuxVitek濁度計 bioMérieux公司；50mL screw cap試管 Corning公司；GELDOCXR凝膠成像系統、CHEF-mapper型脈沖場凝膠電泳儀Bio-Rad公司；純水儀MILLIPORE公司；恒溫培養箱（36±1）℃、厭氧培養盒 MITSUBISHI公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株DNA的制備提純 凍干乳酸桿菌種用常規方法進行復蘇：使用MRS肉湯溶解菌種，置于厭氧盒中37℃條件下培養48h，接種于MRS瓊脂平板，同條件培養48h，選典型菌落轉種MRS瓊脂平板再次同條件培養，之后取適量菌落制成透光度為13%～14%的菌懸液，取300μL，37℃預熱10min后加入30μL溶菌酶（10mg/mL）58℃孵育15min，之后再加入15μL蛋白酶 K（20mg/mL）和300μL溶化的56℃ 1% SeaKemGold：1%SDS瓊脂糖混合，加入模具中室溫下靜置15min；5mLCLB溶液中加入25μL蛋白酶K（20mg/mL）混勻，將凝固成型的膠塊放入蛋白酶K/CLB混合液，54℃水浴搖床（約175r/min）孵育2h；棄去CLB50℃洗滌膠塊（約150r/min）：超純水（10min/次）洗膠塊2次，再用TE（15min/次）洗膠塊4次。

1.2.2 限制性內切酶消化 用刀片切取約2mm寬洗滌后的膠塊，置200μL的1×內切酶緩沖液中，25℃（ApaI、SmaI）及37℃（AscI、XbaI）平衡10min，棄去緩沖液，加入150μL的1×內切酶緩沖液和適量的限制性內切酶，25℃及37℃酶切一定時間，棄去緩沖液，加入200μL的0.5×TBE平衡膠塊10min。

1.2.3 脈沖場凝膠電泳制備 將酶切后的膠塊放置在梳子齒上，將梳子放入膠槽，倒入0.5×TBE配制而成的150mL溶化的1%SKG（SeaKem Gold瓊脂糖），制膠。以0.5×TBE為電泳緩沖液，14℃、120°、6V/cm、Linear Ramping Factor條件下電泳。待電泳結束，取出膠，使用 1μg/mL溴化乙錠溶液染色30min，然后用超純水脫色30min，放入凝膠成像儀照相，記錄電泳結果。

1.2.4 脈沖電泳條件優化 選取了ApaI、SmaI、AscI、XbaI 4種限制性內切酶酶切乳酸桿菌，進行電泳，挑選電泳條帶數目和大小適中的內切酶，并探索該內切酶的最適酶切濃度和酶切時間，本實驗采用了10、30、50、70U/150μL 4個酶切濃度及0.5、2.5、4.5、6.5、8.5h 5種酶切時間，脈沖時間則實驗了0.15～15s、1～15s、1～60s 3種方案。

1.2.5 結果分析 獲得的脈沖場電泳圖譜用BioNumerics數 據 庫 軟 件（AppliedMathsBVBA，Belgium）進行處理，識別圖形條帶，進行樹狀圖自動生成。

2 結果與分析

2.1 限制性內切酶的選擇

從四種內切酶的PFGE電泳圖譜來看，AscI的電泳條帶在電泳凝膠上分布均勻，數目也較為適中，條帶較清晰，容易辨認，顯示出了良好的分型能力。而其余三種酶的電泳條帶多集中于凝膠的前部，且條帶間間隔不清，未完全分開。因此，AscI是比較合適的內切酶。見圖1。

圖1 不同內切酶的乳酸桿菌PFGE圖譜

2.2 酶切液濃度的選擇

從圖2可以看出，當酶切濃度為10U/150μL時，電泳條帶模糊，難以辨別；當酶切濃度為30、50、70U/150μL時酶切效果均較好，條帶相對來說最清楚。因此，30、50、70U/150μL這三種酶切濃度均可選擇，可以認為30U/150μL為最佳酶切濃度。

圖2 不同酶切濃度的乳酸桿菌PFGE圖譜

2.3 酶切時間的選擇

從圖3的幾種酶切時間來看，0.5h的電泳條帶很模糊，較難辨認；2.5h的電泳條帶稍模糊，可以辨認；4.5、6.5、8.5h的電泳條帶均清晰可辨，因此，可以認為4.5h為最合適的酶切時間。

2.4 脈沖時間的選擇

從圖4可以看出，后兩種脈沖時間均可以產生相似且清楚的電泳條帶，只是0.15～15s這個脈沖時間的條帶稍偏下；1～60s脈沖時間的電泳條帶整體過于偏向凝膠的前部，但是仍然較清楚，只是大片段之間距離較遠，而小片段又過近。總的來看，分辨率效果最好的是1～15s，其次是0.15～15s。因此，本實驗最終選擇1～15s作為最佳脈沖時間。

圖3 不同酶切時間的乳酸桿菌PFGE圖譜

圖4 不同脈沖時間的乳酸桿菌PFGE圖譜

2.5 乳酸桿菌標準株的PFGE分析

圖5是22株乳酸桿菌標準菌株的PFGE圖譜，所選內切酶為AscI、酶切時間為4.5h、酶切濃度為30U/150μL、脈沖時間為1～15s。可以看出，同一種乳酸桿菌的PFGE圖譜不盡相同，而不同種的乳酸桿菌有的卻有相同的圖譜。副干酪乳酸桿菌01、07、10、16、18、21中，07、10有相同的圖譜，01、18有相同的圖譜，而16和21則又各有不同的圖譜；兩株植物乳桿菌02、03圖譜相同；鼠李糖乳酸桿菌04、06、08、11、12、13、14、15、17、19、20、22中，04、06、08、12圖譜相同，13、14、19圖譜相同，11、15、17、20、22各有不同的圖譜；嗜酸乳酸桿菌05與發酵乳酸桿菌09有相同的圖譜。縱觀全圖可以明顯看出，04、05、06、07、08、09、10、12圖譜相同，而這些菌分屬不同的種。

2.6 聚類分析

聚類分析結果圖6顯示，22株乳酸桿菌標準株的最高相似性為100%，最低相似性為58.6%。在相似性為60.5%水平上，乳酸桿菌22株標準株被聚為3大類，其中鼠李糖乳桿菌13、14、15、17、19、22、04、06、08、12、20，副干酪乳桿菌07、10、16和嗜酸乳桿菌05，發酵乳桿菌09聚為一簇，植物乳桿菌02、03聚為一簇，副干酪乳桿菌01、18、21及鼠李糖乳桿菌11聚為一簇。在相似性為73.4%水平上，乳酸桿菌五種菌基本可被完全區分開。

圖5 22株乳酸桿菌標準菌株的PFGE圖譜

圖6 22株乳酸桿菌標準菌株PFGE圖譜聚類分析結果

3 討論

表型分型方法對反映物種的起源、進化和變異具有一定的局限性。近年來，從基因水平上進行細菌分型的研究越來越多。脈沖場凝膠電泳是用稀有位點的限制性內切酶對細菌染色體DNA進行消化，將染色體切成5～30條大小約為10～800kb的片段，然后在交變脈沖電場的作用下進行電泳，從而將大小不同的DNA片段分離，穩定性好，分辨率高，分型結果不受表型性狀的易變性帶來的干擾，是目前最理想的分型方法［2-4］。由于使用細菌的原位酶切，酶切位點的突變、基因序列的缺失或插入均會造成的電泳條帶的改變，因而可以顯示基因組的細微變化，這對了解細菌的遺傳特征有重要意義［5］。而要得到理想的分型效果，則必須有合適的電泳條件。

在限制性內切酶的選擇方面，應選擇電泳條帶清楚，條帶數目及片段大小適中的酶，因此，本實驗選擇了AscI作為內切酶。相比來看，其余三種酶則因酶切位點過多而產生了過多的小片段，無法分析。在酶切液濃度的選擇上由于有些酶價格昂貴，因此不得不考慮實驗成本，所以，以圖譜中電泳條帶剛好清晰可辨為原則。故本實驗選擇30U/150μL為最佳酶切濃度。而在酶切時間的選擇上，以酶切完全為原則，故本實驗選擇4.5h作為酶切時間。對于脈沖時間，以圖譜中電泳條帶清楚、分布均勻不成堆且整體位于凝膠中部為原則，因此本實驗選擇的脈沖時間為1～15s。

通過選擇以上合適的分型條件，本實驗比較成功地獲得了乳酸桿菌標準菌株的PFGE圖譜。這個圖譜基本可以區分乳桿菌各種，但種內不同株電泳圖譜的區別并不穩定。通過樹狀圖結合系統發生的觀點來看，相似率為100%則可以證實這些菌株來源于相同的祖先。其中，相似率為100%菌株數最多的一簇中，既包括鼠李糖乳桿菌，又包括嗜酸乳桿菌、發酵乳桿菌、副干酪乳桿菌，說明這些菌株在由同一祖先進化的過程中，可能產生了不同程度的變異而表現出不同的表型特征，從而從屬于不同的種。

總之，AscI酶切的乳酸桿菌標準株的PFGE指紋圖譜，可以在種水平區分各標準株，而且在一定程度上反映了各菌株間的遺傳進化關系，是一種較為理想的分型方法。但目前關于這方面的研究仍然很少，還需要做大量的工作，才能更進一步地進行綜合分析，也才可以為乳酸桿菌在食品醫藥中的安全應用提供可靠的理論依據。

［1］Cross ML.Immune-signalling by orally delivered probiotic bacteria：effectson common mucosalimmunoresponsesand protection at distal mucosal sites［J］.Int J Immunopathol Pharmacol，2004，17：127-134.

［2］Tsen HY，Lin JS，Hu HH，et al.Use of pulsed field gel electrophoresis as an epide miological tool for analysis of sporadic ociated strains of Salmonella typhi isolated in Taiwan［J］.J Appl Microbiol，1999，86（5）：761-768.

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［5］Anand R.Pulsed field gel electrophoresis：A technique for fractionating large DNA molecules［J］.Trends genet，1986，2：278-283.

Optimization in molecular typing of Lactobacillus by pulsed field gel electrophoresis

XU Fei-li1，YANG Xiao-guang2，GUO Yun-chang2，FU Ping2，WANG Hong-xin1，LI Zhi-gang2，LIU Xiu-mei2，*
（1.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.Institute for Nutrition and Food Safety，Chinese Center for Disease Control and Prevention，Beijing 100021，China）

Objective：A method of molecular typing of Lactobacillus was established and optimized by pulsed field gel electrophoresis（PFGE）.Methods：PFGE was used in the genetic typing study of Lactobacillus to optimize the factors influencing the typing of PFGE including different restriction endonuclease，different reaction concentration and reaction time.With these optimized factors，typing research was conducted to the 22 reference strains of Lactobacillus.Results：Restriction endonucleases Ascl was selected in this study with the optimized condition to be reaction concentration of 30U/150μL，reaction time of 4.5 hours and pulse time of 1～15s.By this technique，five electrophoretypes were distinguished in five reference strains of the different species，but the Lactobacillus within a species could not be distinguished by the PFGE.Conclusion：PFGE could be used to classify and identify Lactobacillus.

pulsed field gel electrophoresis（PFGE）；Lactobacillus；molecular typing

TS201.3

A

1002-0306（2011）02-0178-04

2010-08-09 *通訊聯系人

許飛利（1979-），女，博士研究生，研究方向：食品營養與安全。

轉基因生物新品種培育重大專項（2008ZX08011-005）。